重组酰胺酶Dt‑Ami 7、编码基因、载体、工程菌及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于代尔夫特菌Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M 205114的重组酰胺酶Dt‑Ami 7、编码基因、重组载体及工程菌。该酰胺酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌含有重组酰胺酶，可以利用重组大肠杆菌或纯化的重组酰胺酶为催化剂催化系列酰胺化合物的水解。

【技术实现步骤摘要】
重组酰胺酶Dt-Ami7、编码基因、载体、工程菌及应用(一)
本专利技术涉及一种酰胺酶Dt-Ami7及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及该酰胺酶Dt-Ami7或含有该酶的重组细胞为催化剂在催化一系列脂肪族酰胺中的应用。(二)
技术介绍
酰胺酶(Amidase,EC3.5.1.4)能水解酰胺生成相应的羧酸和氨，若在羟胺或者肼存在的条件下则生成相应的氧肟酸和酰肼。作为腈转化酶家族中的重要一员，酰胺酶具有良好的立体选择性，在动力学水解外消旋酰胺或前手性化合物的去对称作用中发挥重要作用。在化学工业中，酰胺酶通常与腈水合酶耦联用于制备各类有机酸，如苯甲酸、丙烯酸、吡嗪酸及烟酸等；同时也被应用于药物合成、废水处理等。在近几年，酰胺酶已成为绿色合成化学的一类关键生物催化剂，日益受到工业界的重视。酰胺酶的来源十分广泛，包括细菌、酵母、真菌，甚至植物和动物。根据划分标准的不同，酰胺酶可以分为很多种。如根据酰胺酶基因的上下游是否存在有编码腈水合酶基因，可以分为与腈水合酶耦联的酰胺酶和非耦联的酰胺酶；根据它们立体选择性的不同，可以划分为S-型酰胺酶和R-型酰胺酶；根据它们的底物专一性可分为短链和中链脂肪族酰胺水解酶；还可以根据氨基酸序列保守区域的不同，划分为酰胺酶标签家族(AmidaseSignatureFamily，AS)和腈水解酶家族(NitrilaseFamily，NF)两大类。目前，国内外报道克隆的酰胺酶多以AS家族为主，关于其酶学特性的表征和研究也较为系统。相对于AS家族酰胺酶，NF家族的酰胺酶研究较少。通常NF家族酰胺酶底物谱较窄，一般只能催化短链脂肪族酰胺水解。克隆该家族的酰胺酶并对其进行表征，可为完善酰胺酶的应用和系统研究，为其分子水平上的分类定义提供坚实的理论基础。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种来源于代尔夫特菌(Delftiatsuruhatensis)ZJB-05174的酰胺酶Dt-Ami7及编码基因、载体，工程菌，以及该酰胺酶的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种来源于代尔夫特菌(Delftiatsuruhatensis)ZJB-05174的重组酰胺酶Dt-Ami7，所述酰胺酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。酰胺酶Dt-Ami7通过基因挖掘的方法获得，所设计的挖掘方法具体为：根据NF家族酰胺酶保守序列有针对性地寻找NCBI收录的基因编码的氨基酸序列，进一步筛选可匹配催化三联体Cys-Glu-Lys的目的序列。选定一批预测的酰胺酶，将所选的酰胺酶进行克隆表达，构建重组大肠杆菌细胞。通过本实验室方法(ZL200510062182)进行酰胺酶活力的筛选，最终获得催化性能较佳的酰胺酶Dt-Ami7。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQNO：2所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本专利技术保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。本专利技术还提供一种所述重组酰胺酶Dt-Ami7在水解酰胺制备羧酸中的应用，所述的应用为：将含重组酰胺酶Dt-Ami7基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH8.0Tris-HCl缓冲液悬浮后进行超声破碎，取上清液纯化(优选Ni-NTA柱层析)后为催化剂，以式(I)或式(Ⅱ)所示化合物为底物，以pH6～9的Tris-HCl缓冲液为反应介质构成反应体系，在25～45℃下进行水解反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得羧酸产物。式(I)中R1为C1～C4烷基，式(Ⅱ)中R2为C1～C4烷基，优选所述脂肪族酰胺化合物为丙酰胺，正丁酰胺，丙烯酰胺，戊酰胺及己酰胺。其特征在于所述催化剂的用量以破碎前湿菌体重量计为1～10g/L反应体系，所述底物初始浓度为20mmol/L反应体系。本专利技术所述催化剂按如下方法制备：(1)将含重组酰胺酶Dt-Ami7基因的工程菌(优选工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-dt-ami7)接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％(v/v)接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，37℃、150rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体；(2)将含重组酰胺酶Dt-Ami7基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH8.0Tris-HCl缓冲液悬浮后进行超声破碎，将破碎混合液离心，取上清液进行Ni-NTA柱层析，以洗脱缓冲液洗脱，收集目标蛋白，将收集的目标蛋白在20mM，pH8.0的Tris-HCl中透析过夜，取透过液即获得催化剂；所述洗脱缓冲液为含终浓度500mM咪唑和终浓度500mMNaCl的20mM、pH8.0Tris-HCl的缓冲液。本专利技术所述上清液纯化方法为：以Ni-NTA为纯化柱，装柱体积为20mL，先用平衡缓冲液(20mMTris-HCl，500mMNaCl和20mM咪唑，pH8.0)平衡Ni-NTA柱，以1.5mL/min的速率上样粗酶液，用平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mMTris-HCl，500mMNaCl和500mM咪唑，pH8.0)洗脱，收集目标蛋白，将收集的目标蛋白在20mM，pH8.0的Tris-HCl中透析过夜(更换2次缓冲液)，透过液即为纯化后的酶液。本专利技术还涉及一种编码所述重组酰化酶Dt-Ami7的基因，优选所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术的酰胺酶Dt-Ami7基因来源于DelftiatsuruhatensisCCTCCNo.M205114，具体制备方法为：根据Genbank中收录的预测为酰胺酶的基因序列设计合成引物，较佳的，上游引物为：CATATGAGACACGGAGATATTTCCAGC；下游引物为：GAATTCTCAGCGGTGCTTGGGCG；然后以DelftiatsuruhatensisCCTCCNo.M205114基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得全长1038bp的酰胺酶Dt-Ami7基因序列。其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示，该序列编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQNO：1所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本专利技术保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。本专利技术还涉及一种由所述编码基因构建的重组载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本专利技术的酰胺酶Dt-Ami7核苷酸序列连接于各种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis)ZJB‑05174的重组酰胺酶Dt‑Ami 7，其特征在于所述酰胺酶Dt‑Ami 7的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种来源于代尔夫特菌(Delftiatsuruhatensis)ZJB-05174的重组酰胺酶Dt-Ami7在水解酰胺制备羧酸中的应用，其特征在于所述的应用为：将含重组酰胺酶Dt-Ami7基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH8.0Tris-HCl缓冲液悬浮后进行超声破碎，取上清液纯化后作为催化剂，以式(I)或式(Ⅱ)所示化合物为底物，以pH6～9的Tris-HCl缓冲液为反应介质构成反应体系，在25～45℃下进行水解反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得羧酸产物；所述酰胺酶Dt-Ami7的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示；式(I)中R1为C1～C4烷基，式(Ⅱ)中R2为C1～C4烷基。2.如权利要求1所述应用，其特征在于所述催化...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑裕国，郑仁朝，吴哲明，沈寅初，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33