一种雄激素受体基因敲除试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种雄激素受体基因敲除试剂盒。本发明专利技术所述的雄激素受体基因敲除试剂盒包括：质粒AR-CAS9，其含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为SEQ ID No:1所示的RNA序列，该RNA序列能形成特异识别雄激素受体基因的外显子1部分序列的sgRNA，该sgRNA与trRNA构成特异的识别结构，从而引导CAS9酶特异地剪切雄激素受体基因的外显子1对应序列；以及检测试剂，用于检测雄激素受体基因的外显子1的剪切效果。本发明专利技术所述的雄激素受体基因敲除试剂盒可用于定向雄激素受体基因的敲除，具有效率高、速度快、简单经济的特点，在动物模型构建及医学临床应用方面前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种雄激素受体基因敲除试剂盒
本专利技术属于基因工程领域，涉及基于CRISPR-CAS9基因敲除技术的雄激素受体基因敲除载体的构建及试剂盒的开发和应用。
技术介绍
雄激素是一种含19个碳原子的类固醇激素，主要有睾酮(testosterone，T)、二氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)、脱氢异雄酮(dehydroisoandrosterone，DHIA)和雄烯二酮(androstenedione，AD)，以睾酮为主，促进男性附性器官成熟及第二性征出现，并维持正常性欲及生殖功能。雄激素参与了体内许多生长发育和代谢的过程。雄激素主要通过在其靶器官中的特异的雄激素受体(AR，androgenreceptor)发挥其各种生理效应。雄激素受体(androgenreceptor，AR)是一种核激素受体类转录因子，AR信号通路对于男性生殖器官的正常生长、终末分化和功能是必需的。在发育期间，AR在泌尿生殖窦的间质表达，当被其配体雄激素激活后便能诱导上皮细胞分化和器官的形态发生。AR的作用机制：雄激素受体在胞质中能与热休克蛋白结合，当雄激素受体与雄激素结合后，雄激素受体被激活并与热休克蛋白解离。雄激素受体进入细胞核，通过与靶基因上的雄激素反应元件的顺式作用增强子作用，从而在转录水平上调节基因表达。雄激素受体的转录激活功能由核受体辅助激活因子介导，这些辅助因子通过多级作用催化组蛋白乙酰化和去甲基化而修饰染色质结构，促进RNA聚合酶Ⅱ转录起始复合物与启动子结合，激活基因转录，表达蛋白质，进而控制细胞生长。前列腺是人体的最大性腺体，与雄激素通路密切相关。临床上主要是前列腺增生和前列腺癌。前列腺增生(BPH)是老年男性最常见的疾病，是引起中、老年男性排尿障碍性疾病的主因。近年来，随着我国国民生活水平和卫生条件的改善，平均寿命的延长，BPH的发生率也明显上升。另一方面，前列腺癌是西方国家最常见的恶性肿瘤之一，是引起老年男性死亡的第二位原因。我国的前列腺癌发病率远低于欧美国家，但近年来有上升趋势。雄激素受体(AR)是前列腺上皮细胞生长、分化及恶性转化等信号传递系统的交叉点，与前列腺癌(prostatecancer，Pca)的发生、发展有关的信息均要通过AR往下游或相互间传递。正常前列腺和前列腺癌发生发展过程中的细胞存活依赖于雄激素受体。DHT是睾酮的活性形式，它与AR结合后，使后者与部分热激蛋白分离，并发生构象变化，使其发生核转位，同时易位至细胞核。在细胞核内AR二聚化，招募一系列共激活因子，与RNA聚合酶Ⅱ等形成转录增强复合体，通过与靶基因启动子DNA反应单元结合，调控细胞的转录程序，从而激活与细胞生长和存活相关的基因转录。近年来一些研究发现，在一些非性激素靶组织的肿瘤中存在一定的性激素依赖性，如甲状腺癌、肺癌、脑瘤、胰腺癌、肠癌和肝癌等。随着研究的深入，现在能够对这种现象在分子水平上作出解释。现在认为雄激素可通过AR的介导：①AR的N端具有某些转录活化因子，可与c-fos、e-jun、rag等与细胞增殖和分化有关的癌基因相互调节，促进细胞增殖；②AR可控制细胞的程序性死亡过程，导致转化细胞和肿瘤细胞生长优势；③刺激一些生长因子的表达而促进细胞增殖，如表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子等；AR与雄激素结合后，通过旁分泌和自分泌机制使靶组织对生长因子的刺激更敏感，从而使细胞增殖旺盛。④调节与细胞周期有关的调节蛋白，eyclin—B2的表达，促进细胞分裂。而影响激素依赖性肿瘤细胞的增殖。综上所述，雄激素通路涉及众多的生理和病理过程，是临床研究的重要通路。早在1941年，美国著名医学家哈金斯就发现了前列腺癌的这种治疗方法，并荣获1966年的诺贝尔医学奖。目前针对雄激素受体通路的治疗对于前列腺增生(例如：5α还原酶抑制剂)和前列腺癌(例如：“去势”治疗)仍是临床的首选治疗。因此加强雄激素通路的研究具有重要的临床意义。CRISPR-CAS9是一种最新基因组定向基因编辑技术，是来源于细菌获得性免疫的由RNA指导CAS9蛋白对靶向基因进行修饰的技术。在改造后的CRISPR-CAS9系统中，sgRNA通过与靶位点结合引导CAS9蛋白识别PAM序列，同靶基因结合在PAM区上游对基因组DNA进行切割，从而造成双链断裂，引发非同源末端连接修复。在修复过程中个别碱基的缺失或插入会造成移码突变，从而达到基因组定点编辑的目的。利用该技术可在局部实现非同源重组与同源重组，已成为高效的基因敲除工具。可在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切。利用CAS9作为切口酶可以高效地介导基因定点敲入或是对基因组的点突变，大大降低了非同源末端连接风险和脱靶事件导致的基因组其他位置产生未知的突变。CRISPR-CAS9主要包括以下三个部分，crRNA、tracrRNA和CAS9蛋白。在转录的过程中，CRISPR簇首先转录为前crRNA，然后逐渐被加工成小的crRNA(CRISPRRNA)。反式作用RNA即tracrRNA(transactivatingcrRNA)主要用来加工crRNA，crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合，形成双链RNA。tracrRNA:crRNA二元复合体指导CAS9蛋白识别保守的间隔相邻基序(proto-spaceradjacentmotifs，PAM基序)，在crRNA引导序列的特定位点剪切双链DNA。传统对于基因组基因的定向改造非常困难，细胞水平一般采用RNAi技术以实现基因表达的抑制，但无法达到基因敲除。而动物水平则只能通过同源重组(homologousrecombination)方式来获得基因改造的子代，整个实验时间周期长。而CRISPR-CAS9可以直接在细胞水平实验对基因的改造(包括敲除)，从而大大加快基因敲除动物的实验进展。编码AR的基因位于X染色体的q11-12区带，为单拷贝基因，总长度大于90kb，由8个外显子组成，外显子1最大，编码受体N端的残基也最不保守。其N端结构域与AR的转录激活有关，该区域包含2种多聚体，即多聚谷氨酸和多聚脯氨酸，它们被认为在转录激活方面起着重要作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种雄激素受体基因敲除试剂盒，可用于高效、快速、方便地定向敲除雄激素受体基因。本专利技术所述的雄激素受体基因敲除试剂盒包括：(1)质粒AR-CAS9，其含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为SEQIDNo:1所示的RNA序列，该RNA序列能形成特异识别雄激素受体基因的外显子1部分序列的sgRNA(shortguideRNA)，该sgRNA与trRNA(trans-activatingRNA)构成特异的识别结构，从而引导CAS9酶特异地剪切雄激素受体基因的外显子1对应序列；(2)检测试剂，用于检测雄激素受体基因的外显子1的剪切效果。根据本专利技术所述的雄激素受体基因敲除试剂盒的进一步特征，所述互补的DNA序列为SEQIDNo:2和SEQIDNo:3。根据本专利技术所述的雄激素受体基因敲除试剂盒的进一步特征，所述质粒AR-CAS9是用包括如下步骤的构建方法构建的：以PX330质粒作为起始载体，先用Bbsl酶切并回收骨架；设计合成SEQIDNo:2和SEQIDNo:3两本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种雄激素受体基因敲除试剂盒，包括：(1)质粒AR‑CAS9，其含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为SEQ ID No:1所示的RNA序列，该RNA序列能形成特异识别雄激素受体基因的外显子1部分序列的sgRNA(short guide RNA)，该sgRNA与trRNA(trans‑activating RNA)构成特异的识别结构，从而引导CAS9酶特异地剪切雄激素受体基因的外显子1对应序列；(2)检测试剂，用于检测雄激素受体基因的外显子1的剪切效果。

【技术特征摘要】
1.一种雄激素受体基因敲除试剂盒，包括：(1)质粒AR-CAS9，其含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为SEQIDNo:1所示的RNA序列，该RNA序列能形成特异识别雄激素受体基因的外显子1部分序列的sgRNA，该sgRNA与trRNA构成特异的识别结构，从而引导CAS9酶特异地剪切雄激素受体基因的外显子1对应序列；(2)检测试剂，用于检测雄激素受体基因的外显子1的剪切效果。2.根据权利要求1所述的雄激素受体基因敲除试剂盒，其特征在于：所述互补的DNA序列为SEQIDNo:2和SEQIDNo:3。3.根据权利要求2所述的雄激素受体基因敲除试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：江福能，钟惟德，刘文华，
申请(专利权)人：广州辉园苑医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44