血浆样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法技术

本发明专利技术涉及一种血浆样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法，所述测定方法包括：血浆样品前处理步骤：在0～4℃下，按体积比为1：5混合动物给予2,3-吲哚醌后采集的血浆样品和内标物甲醇溶液，涡旋30～90秒后离心取上清液；以及通过液相色谱-质谱联用对经前处理的血浆样品进行检测的检测步骤，其中液相色谱条件包括：色谱柱为Ascentis，RP-Amide，5μm，50×2.1mm；色谱流动相A为5mM甲酸铵/5mM甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积百分比分别为55%和45%；质谱条件包括：质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气压力为50psi；气体流速为9L/min；毛细管电压为4500V；离子源温度为350℃，内标法定量。

【技术实现步骤摘要】
,3-吲哚醌的浓度的测定方法【专利摘要】本专利技术涉及一种,3-吲哚醌的浓度的测定方法，所述测定方法包括：血浆样品前处理步骤：在0～4℃下，按体积比为1：5混合动物给予2,3-吲哚醌后采集的血浆样品和内标物甲醇溶液，涡旋30～90秒后离心取上清液；以及通过液相色谱-质谱联用对经前处理的血浆样品进行检测的检测步骤，其中液相色谱条件包括：色谱柱为Ascentis，RP-Amide，5μm，50×2.1mm；色谱流动相A为5mM甲酸铵/5mM甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积百分比分别为55%和45%；质谱条件包括：质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气压力为50psi；气体流速为9L/min；毛细管电压为4500V；离子源温度为350℃，内标法定量。【专利说明】, 3-吲哚醌的浓度的测定方法
本专利技术属于生物医药检测领域，涉及一种内源性活性化合物2，3_吲哚醌的生物体内血浆样品中的浓度的测定方法。
技术介绍
2，3-Π引哚醌(2，3-1ndolined1ne, Isatin, ISA),又名靛红,是近年发现存在于人和动物体内的一种内源性活性因子,具有多种生物活性。 液相色谱与质谱联用技术(LC-MS)，尤其是其中的液相色谱-大气压电离质谱联用技术(LC-AP1-MS)，是目前分析生物样品中痕量物质的首选。它兼具了液相色谱与质谱两种技术的优点，具有高灵敏度和专一性，，并大大缩短分析时间。 目前，已有报道的2，3-吲哚醌测定方法有ECL、GC-MS、LC-MS以及HPLC等方法，这些方法大多样品前处理复杂，有些需要对生物样品进行多步纯化处理，实验操作过程比较繁琐，而且样品分析时间较长，被用于2，3-吲哚醌的体内药代动力学研究中大批生物样品的分析测试方法还很少，且存在以上问题，因此在处理药代动力学研究中所产生的大量样品就需要开发高通量的快速分析方法，特别是样品前处理简便、检测手段灵敏的快速分析方法。例如中国专利CN102735764A公开一种血浆中利巴韦林含量的测定方法，该方法使用较为简便的血浆预处理方法，并使用LC-MS法检测，灵敏度较高。但是目前关于，3-吲哚醌浓度的快速简便灵敏的测定方法还鲜有报道。
技术实现思路
基于2，3-吲哚醌的临床前药代动力学研究中存在的生物样品浓度分析方法中的问题，本专利技术的目的在于提供一种高通量快速检测血浆中2，3-吲哚醌浓度的一种液质联用分析方法。 在此，本专利技术提供一种，3-吲哚醌的浓度的测定方法，包括:血浆样品前处理步骤:在O?4°C下，按体积比为1:5混合动物给予2，3-吲哚醌后采集的血浆样品(含2，3-吲哚醌的血浆样品)和内标溶液，涡旋30?90秒后离心取上清液，其中所述内标溶液为10ng/mL的奎硫平甲醇溶液；通过液相色谱_质谱联用对经前处理的血浆样品进行检测的检测步骤，其中 液相色谱条件包括:色谱柱为Ascentis, RP-Amide, 5 μ m, 50 X 2.1mm ;色谱流动相A为5mM甲酸铵/5mM甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积百分比分别为55%和45% ；质谱条件包括:质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气压力为50psi ;气体流速为9L/min ;毛细管电压为4500V ;离子源温度为350°C，内标法定量。 本专利技术通过甲醇蛋白沉淀法处理血浆样品，用液相色谱质谱联用仪器分析，3-吲哚醌的浓度。因此，本专利技术的方法具有前处理简便、检测手段灵敏专一、检测速度快的优点。本专利技术的方法的准确度、精密度及检测限符合生物样品分析方法学验证要求，能够满足2，3-吲哚醌的药代动力学研究中血浆样品的浓度测定需要。 在所述血浆样品前处理步骤中，所述内标物甲醇溶液优选为10ng/mL的奎硫平甲醇溶液。又，所述离心优选为以15000r/min的速度离心5min。 又，在所述检测步骤中，所述液相色谱条件还包括:柱温为40°C ；自动进样器温度为6°C ;洗针液为异丙醇水溶液，其中，异丙醇与水的体积比为1:1 ;分析时间为2分钟,流速为400 μ L/min,进样量为5 μ L。 在所述检测步骤中，所述质谱条件还包括:用于定量分析的离子对为:2，3-吲哚醌:148 — 65.1 ;奎硫平:384.1 — 253.1。 本专利技术中，所述血浆样品是哺乳动物的血浆。 在一个示例中，所述血浆样品是动物给予2，3-吲哚醌后采集的新鲜血浆样品。 在又一个示例中，所述血浆样品是动物给予2，3-吲哚醌后采集的血浆样品存放于-80°C冰箱的储备血浆样品，所述血浆样品前处理步骤还包括在与所述内标物甲醇溶液混合前先将所述储备血浆样品从_80°C冰箱取出，于O?4°C下自然融化后漩涡20?40秒。 本专利技术中，所述测定方法的最低检测限为10ng/mL。能够满足于低含量2，3_吲哚醌的检测。 本专利技术中，所述测定方法的相对误差和相对标准偏差均在20%以内，重现性和可靠性较高，具有较高的稳定性。 【专利附图】【附图说明】 图1是大鼠血浆中选择性样品色谱图，其中图1 (a)是空白血浆的2，3_吲哚醌色谱图，图1 (b)是空白血浆的奎硫平色谱图，图1 (C)是空白血浆加内标的2，3-吲哚醌色谱图，图1 (d)是空白血浆加内标的奎硫平色谱图；图2是大鼠血浆中最低定量下限样品色谱图，其中图2 Ca)是2，3-吲哚醌色谱图，图 2(b)是奎硫平色谱图；图3是大鼠血浆系统残留样品色谱图，其中图3 (a)是2，3-吲哚醌色谱图，图3 (b)是奎硫平色谱图；图4是Beagle犬(比格犬)血浆中选择性样品色谱图，其中图4 Ca)是空白血浆的2，3-吲哚醌色谱图，图4 (b)空白血浆的是奎硫平色谱图，图4 (c)是空白血浆加内标的2，3-吲哚醌色谱图，图4 Cd)是空白血浆加内标的奎硫平色谱图；图5是Beagle犬(比格犬)血浆中最低定量下限样品色谱图，其中图5 (a)是2，3_吲哚醌色谱图，图5 (b)是奎硫平色谱图；图6是Beagle犬(比格犬)血浆系统残留样品色谱图，其中图6 Ca)是2，3_吲哚醌色谱图，图6 (b)是奎硫平色谱图。 【具体实施方式】 以下，参照附图，并结合下述实施方式进一步说明本专利技术。应理解这些实施方式和实施例仅用于说明本专利技术，而不用于限制本专利技术。 本专利技术提供了一种高通量快速检测血浆中2，3-吲哚醌浓度的一种液质联用分析方法，涉及:(I)血浆样品的蛋白沉淀前处理方法；(2)，3-吲哚醌标准曲线的制备；(3)液相色谱分离方法；(4)质谱检测方法；(5)结果的计算。 本专利技术通过甲醇蛋白沉淀法处理血浆样品，用液相色谱质谱联用仪器分析，3-吲哚醌的浓度。本方法的准确度，精密度及检测限符合生物样品分析方法学验证要求，能够满足2，3-吲哚醌的药代动力学研究中血浆样品的浓度测定需要。 作为一个示例，本专利技术的方法可涉及以下方面。 (I)血浆样品的蛋白沉淀前处理:取50 μ L血浆样品至1.5mL离心管中，加入250 μ L内标溶液(例如，10ng/mL奎硫平甲醇溶液)，涡旋30~90秒后离心(例如15000r/min，离心5分钟4°C);取上清液100 μ L至Agilen本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血浆样品中2,3‑吲哚醌的浓度的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括：血浆样品前处理步骤：在0～4℃下，按体积比为1：5混合动物给予2,3‑吲哚醌后采集的血浆样品和内标物甲醇溶液，涡旋30～90秒后离心取上清液；以及通过液相色谱‑质谱联用对经前处理的血浆样品进行检测的检测步骤，其中液相色谱条件包括：色谱柱为Ascentis，RP‑Amide，5μm，50×2.1mm；色谱流动相A为5mM甲酸铵/5mM甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积百分比分别为55%和45%；质谱条件包括：质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气压力为50psi；气体流速为9L/min；毛细管电压为4500V；离子源温度为350℃，内标法定量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈春麟，吕文旭，王涛，陈昊，汪俊，
申请(专利权)人：上海美迪西生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31