测定血斑中血浆铜蓝蛋白浓度的方法及肝豆状核变性病筛选试剂盒和诊断试剂技术

本发明专利技术涉及测量全血浆铜蓝蛋白浓度的方法，特别涉及使用全血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体和全血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体，利用通过酶联免疫吸附测定法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）或解离强化的时间分辨荧光免疫测定法（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓｙ）得到的标准浓度曲线，测定全血浆铜蓝蛋白浓度的方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及测量全血浆铜蓝蛋白(holoceruloplasmin)浓度的方法，特别涉及使用全血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体和全血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体，利用通过酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)或解离强化的时间分辨荧光免疫测定法(dissociation-enhanced time-resolved fluoroimmunoassy)得到的标准浓度曲线，测定全血浆铜蓝蛋白浓度的方法。
技术介绍
测定全血浆铜蓝蛋白浓度的方法，对Wilson病的诊断有非常重要的作用。Wilson病又称肝豆状核变性病(Wilson′s disease)，1912年第一次被报道，是现今全世界以25,000-30,000名中1名的频率发生的一种常染色体隐性疾病，其遗传携带率为90/1，是较为常见的遗传疾病之一。对铜代谢过程引起障碍的Wilson病伴有通过胆管的铜排泄减少、铜吸收于血浆铜蓝蛋白中有异常等特点。因铜胆管排泄的障碍，铜沉积于肝、脑、角膜、红血球、肾胀等器官，引起肝炎、肝硬变等肝功能障碍，说话障碍等神经障碍，溶血性贫血、肾小管功能异常等现象。大部分Wilson病患者们都是以发生肝硬化、神经血损伤等疾病之后才发现，因此，需要肝移植或无法治疗，甚至引起死亡，是一种致命的疾病。但如能早期发现，利用D-青霉胺(D-phenicillamine)，三亚乙基四胺等螯合剂等试剂，进行早期的适当治疗，就不能引起并发病，能谋求正常生活，因此，Wilson病的早期诊断和治疗对患者的治疗有非常重要的意义。血液内的血浆铜蓝蛋白浓度是Wilson病诊断中重要的指标之一。血浆铜蓝蛋白是一种分子量为132,000道尔顿，且具有每一个分子能与6个铜原子结合的结构的物质，是一种在正常情况下，含生物体内铜量的95％左右的血浆蛋白质，起着把铜运输到组织内，提高芳香族胺氧化酶的活性，抗拴化作用，除去自由基及过氧化氢，调节炎症性反应等作用。血浆铜蓝蛋白在正常人血清内的含量为20-50mg/dl(200-500μg/ml)左右。但在Wilson病患者的血清内的含量特别少。通常，血浆铜蓝蛋白大部分有氧化酶活性，以含铜的全血浆铜蓝蛋白形态存在；正常人可有效地排泄掉铜，并且在体内没有氧化酶活性的脱辅基血浆铜蓝蛋白(apoceruloplasmin)的数量很少(3.3±3.1mg/dl33±31μg/ml)。与之相反，尽管Wilson病患者的脱辅基血浆铜蓝蛋白的量与正常人基本相同，其全血浆铜蓝蛋白数量很少(2.7±2.0mg/dl27±20μg/ml)。所以，测定血液内的血浆铜蓝蛋白，特别是全血浆铜蓝蛋白的方法对灵敏地诊断Wilson病有重要的意义。同时，在新生儿时期，血浆铜蓝蛋白浓度的测定量为很低，因此，筛选检查效率也比较低。所以，其浓度达到正常成人水平的3-5水左右为筛选检查的最佳时期。从前的血浆铜蓝蛋白测定方法，是利用血清的通过血浆铜蓝蛋白氧化酶活性(oxydase activity)测定全血浆铜蓝蛋白的方法、利用多克隆抗体的放射性免疫扩散法(radial immunodiffusion assay)、免疫浊度测定法(immnunoturbidimetic assay)等。血浆铜蓝蛋白氧化酶活性的测定方法对血浆铜蓝蛋白没有特异的酶底物，所以，很难测定血浆铜蓝蛋白。利用多克隆抗体的测定方法中，多克隆抗体，跟全血浆铜蓝蛋白结合的同时，也跟脱辅基血浆铜蓝蛋白结合，所以有特异性低的特点。而且，要实现上述方法，得采集大量血液、经过另行的血液离心分离过程分离血清、采集后，因血清内蛋白质的稳定性问题，在保存和搬运的过程重要时刻保持冰冻状态，具有很大的不便性。如同上述，现有的方法，在采集、搬运、保存等方面都很不方便，且一次能测定的样品的数也受限制，因此，此方法在测定大量样品的全国性的筛选检查中不易使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供使用全血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体和全血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体，利用通过酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbent assay；ELISA)或解离强化的时间分辨荧光免疫测定法(dissociation-enhanced time-resolved fluoroimmunoassy)得到的标准浓度曲线，测定全血浆铜蓝蛋白浓度的方法。本专利技术的再一个目的是提供利用对全血浆铜蓝蛋白分子的氧化酶活性重要的，能识别跟抗原决定簇(epitope)分子一样的别的抗原决定簇的两个单克隆抗体，或单克隆抗体和多克隆抗体，或两个多克隆抗体，以夹心法定量分析血液内的全血浆铜蓝蛋白，从而早期诊断Wilson病的方法。本专利技术的再一个重要的目的是提供用包含全血浆铜蓝蛋白的精制的血浆铜蓝蛋白免疫兔子，得到血清并制造血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体的方法。本专利技术的再一个重要的目的是提供用包含全血浆铜蓝蛋白的精制的血浆铜蓝蛋白免疫小鼠，得产生抗体的脾脏细胞，把上述脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合及培育，得单克隆化的杂交瘤细胞并制造血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体的方法。本专利技术的再一个重要的目的是提供以制造标准血液斑点和对照血液斑点的方法，及分别利用偶联有辣根过氧化物酶标记的血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体及单克隆抗体，通过酶联免疫吸附测定法，以夹心法，制作吸光度标准曲线的方法。本专利技术的再一个重要的目的是提供以制造标准血液斑点和对照血液斑点的方法，及利用以铕(Europium；Eu3+)标记的血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体及单克隆抗体，通过解离强化的时间分辨荧光免疫测定法，以夹心法，制做标准浓度曲线的方法。本专利技术的再一个重要的目的是提供使用全血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体和全血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体，标准血液斑点及对照血液斑点，利用通过酶联免疫吸附测定法或解离强化的时间分辨荧光免疫测定法得到的标准浓度曲线，测定全血浆铜蓝蛋白浓度的方法。本专利技术的再一个重要的目的是提供早期诊断Wilson病的筛选检查试剂盒，从而提供与现今使用的检测法有区别的，从血液过滤纸收集的1-7岁幼儿的血液斑点中，通过酶联免疫吸附测定法或解离强化的时间分辨荧光免疫测定法，定量分析把含铜的全血浆铜蓝蛋白的方法。从而，测定血浆铜蓝蛋白时，不必采集大量血液，用1-2滴血液就可进行筛选检查。本专利技术的最终目的是为了实现一次性地测定多数的样品，提供利用样品的采集、搬运、保存都非常方便的血液斑点，通过使用酶联免疫吸附测定法或解离强化的时间分辨荧光免疫测定法，定量分析把含铜的全血浆铜蓝蛋白的方法，便能早期诊断Wilson病。在本研究里，开发两种方法的原因是现在全世界开发的其他疾病的筛选检查用试剂盒(kit)，都采用这两种方法之一。附图说明图1表示把包含全血浆铜蓝蛋白的精制的血浆铜蓝蛋白(11)和血浆铜蓝蛋白特异性抗体的混合液，在37℃反应，把得到的反应物(2)电泳得凝胶体，把这凝胶体用氧化酶活性染色法染色的结果。图2表示利用包含几种浓度的血浆铜蓝蛋白的标准血液斑点，使用本专利技术开发的酶联免疫吸附测定法得到的标准浓度曲线。图3表示利用包含几种浓度的血浆铜蓝蛋白的标准血液斑点，使用本专利技术开发的解离强化的时间分辨荧光免疫测定法得到的标准浓度曲线。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血液斑点中测定全血浆铜蓝蛋白浓度的方法，其特征在于，使用全血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体和全血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体，利用通过酶联免疫吸附测定法得到的吸光度标准曲线测定。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：韩始薰，章暎珠，李秀英，申夏澈，朴善荣，柳恩善，韩熙成，
申请(专利权)人：智诺百股份有限公司，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]