一种测定人血浆中抗病毒药物浓度的方法技术

本发明专利技术属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种可同时测定人血浆中抗病毒药物阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦浓度的方法。本发明专利技术方法对待测样品经预处理后，利用阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦在酸性条件下有强的荧光吸收的特征，经酸性流动相在色谱柱分离后，用荧光检测器检测。该法使检测药物浓度的灵敏度明显提高。本方法样品取样少，预处理简单、快速、灵敏，无需昂贵的设备和试剂，分析周期短，成本低，适合于所述药物的临床常规血药浓度的监测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测 定人血桨中抗病毒药物浓度的方法。
技术介绍
目前，临床用于治疗病毒性疾病的抗病毒药物若干，阿昔洛韦(Acyclovir， ACV)、更昔洛韦(Ganciclovir， GCV)和喷昔洛韦(Penciclovir, PCV)是目前临床上常 用的核苷类抗病毒药物。其中ACV与GCV是最重要的抗巨细胞病毒药物。PCV 主要对I 、 II型单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒和乙型肝炎病毒等具有强效抑 制作用。当PCV与ACV或GCV合用，临床疗效明显增强。由于三种药物的药 动学个体间差异大、合并用药普遍、肝肾功能异常会导致药物血浆浓度和药效变 化，因此通过检测血浆中上述药物的浓度来调整给药剂量，对保证用药的安全和 有效有重要的临床意义。目前医学检验中，国内有分别测定人血叛中有关抗病毒药物浓度的方法的 报道，但所述方法存在灵敏度低、操作繁琐费时、效率低、分析成本高等种种缺 陷，不适合常规治疗药物浓度监测；国外尚未见相关的同时测定人血浆中ACV、 GCV和PCV的浓度的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种简便、快速、灵敏、可同 时测定体内阿昔洛韦(Acyclovir, ACV)、更昔洛韦(Ganciclovir, GCV)和喷昔洛韦 (Penciclovir， PCV)的血药浓度的方法。本方法无需昂贵的设备和试剂，具有操作简便、快速、血浆用量少、成本 低等优点，适合常规血药浓度监测。本专利技术方法的技术方案是:待测样品预处理后，经酸性流动相在色谱柱分离， 用荧光检测器检测，包括下述步骤-1)样品预处理取待测样品，加入定量的蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀、离心、取上清液进样， 所述的蛋白沉淀剂为7~20%的高氯酸溶液；2) 样品分离采用通用型的液相色谱柱，其填料为Diamonsil C18，高效液相系统采用 通用型高压泵和进样器，采用0.08 0.1。/。三氟乙酸(TFA)水溶液(？11=2.1-2.5) 和甲醇的混合液作为流动相，梯度洗脱；梯度洗脱模式优选0 7 min为0.08-0.1% TFA水溶液-甲醇(96:4,V/V)， 7.01 10.0 min为0.08 0.ly。TFA水溶液-甲醇(40:60，V/V)， 10.01 12.5min 为0.08-0.1。/oTFA水溶液-甲醇(96:4,V/V);3) 样品检领!j采用通用型荧光检测器检测ACV、 GCV和PCV的峰面积，荧光激发波 长为260ilnm，发射波长为380± 1 nm，用标准曲线方程换算成浓度。 本方法具有以下优点1. 采样量少测定一份样品只需0.2ml血浆样本；2. 预处理简便 一步高氯酸溶液蛋白沉淀，简便易行，适用于常规检测；3. 灵敏度高根据ACV、 GCV和PCV在酸性条件下具有强荧光吸收的特性， 采用酸性流动相和荧光检测，明显提高检测灵敏度，ACV、 GCV和PCV的 最低定量限均为20吗'L/1，显著优于现有技术公开的GCV 100 、 ACV 100 jag-I/1禾卩PCV的40 pg'L-1;测定时间短整个色谱分析测定过程为12.5 min。 本方法所述的ACV、 GCV和PCV测定的线性范围均为20 2000吗七-1， 方法回收率均大于91%，日内和日间的精密度(相对标准差，RSD)均小于8。/。。 本专利技术方法快速准确、操作简便、灵敏度高、成本低，适合临床常规监测。 附图说明图1:典型色谱图其中，A:未服用阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦受试者的空白血浆；B:空 白血浆+阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦标准品(阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔 洛韦三者的浓度均为20吗'L");1:内标(鸟苷酸)；2:更昔洛韦；3:阿昔洛韦；4:喷昔洛韦。图2:服用阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦受试者的色谱图，其中，1:内标(鸟苷酸)；2:更昔洛韦(浓度为692.6 )1g'L"); 3:阿昔洛韦(浓度为760.3吗'L"); 4:喷昔洛韦(浓度为910.5 ng'L")。图3为受试者服用所述三种抗病毒，图3:同时服用阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦药物后的受试者的分析色谱图，其中，1:内标(鸟苷酸)；2:更昔洛韦(浓度为692.6吗'L"); 3:阿昔洛韦(浓度为760.3吗'L"); 4:喷昔洛韦(浓度为910.5吗七")。具体实施方式 实施例1色谱条件HPLC系统色谱柱Diamonsil C18 (200 mm x 4.6 mm， 5 (am)，流动相采用 梯度洗脱，0 7 min为0.08 % TFA-甲醇(96:4,V/V)， 7.01 10.0 min为0.08%TFA-甲醇(40:60，V/V)， 10.01 12.5min为0.08。/。TFA-甲醇(96:4,V/V)，流速1.5 mL.min";柱温25 。C;荧光激发波长260 ± 1 nm，发射波长380 ± 1 nm。血浆样品预处理精密吸取200 pL血浆置1.5 mL离心管中，加含内标鸟苷酸的7%高氯酸溶 液50tiL，涡旋振荡提取30s，离心15 min (10000 x g， 4。C)，取上清液40pL 进样，内标法以峰面积定量。专属性取不同来源的10名未服用ACV、 GCV和PCV的受试者的空白血浆，按 照上述样品预处理和测定方法进行测定，结果显示，未发现血浆内源性物质对上 述测定组分有干扰；此外，常见合并用药缬更昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、喷 昔洛韦、利巴韦林、阿西美辛、吲哚美辛、阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、环 孢素、他克莫司、西罗莫司、强的松、咪唑立宾、麦考酚酸、阿司匹林、对乙酰 氨基酚等对测定没有干扰。内标鸟苷酸、ACV、 GCV和PCV的典型色谱保留 时间分别为3.9 、 6.8 、 5.1禾Q7.8min，整个色谱分析过程时间为12.5 min。线性试验精密称取ACV、 GCV和PCV标准物质适量，用50%甲醇溶解，稀释成系 列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含ACV20、 100、 500、 1000、 1500、 2000吗'I/1, GCV20、 100、 500、 1000、 1500、 2000 pg.L-1和PCV 20、 100、 500、 1000、 1500、 2000ixg'L"的标准血样。取血浆200 pL，按，，血浆样品预处理"方法 操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比(^)和待测组分浓度(C)作加权 (1/d)线性回归，线性范围均为20 2000昭'L—1，最低定量限均为20 ^L—1，三 者的标准曲线回归方程分别为ACV ^=0.00117C-0.00373, r=0.9996; GCV ^=0.00135 C-0.000682，产0.9997; PCV^=0.00345 C-0.0117, r=0.9996。准确度和精密度精密称取ACV、 GCV和PCV标准物质适量，50%甲醇溶解并稀释成系列 工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含ACV40、 800、 1600吗.U1， GCV40、 800、 1600吗'L"和PCV40、 800、 1600的系列血样，各取血浆20(HiL,按，， 血浆样品预处理"方法操作，考察日内和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定人血浆中抗病毒药物浓度的方法，其特征是待测样品预处理后，在酸性流动相下，经色谱柱分离后，用荧光检测器检测，包括以下步骤：１）样品预处理测定血浆浓度：取待测样品，加入７～２０％高氯酸溶液，进行蛋白沉淀，离心后，取上清液 进样；２）样品分离采用通用型的液相色谱柱，其填料为ＤｉｋｍａＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ↓［１８］，高效液相系统采用通用型的荧光检测器以及高压泵，流动相为酸性，梯度洗脱；３）荧光检测器检测荧光激发波长２６０± １ｎｍ，发射波长３８０±１ｎｍ，测定峰面积，用标准曲线方程换算成浓度。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：道毅俊，焦正，钟明康，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]