本发明专利技术属于分子生物学领域。本发明专利技术涉及用于从RNA模板产生核酸并进一步进行核酸复制的新型组合物、方法和试剂盒。特别地，本发明专利技术涉及通过反转录酶-聚合酶链反应来产生并扩增核酸。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术属于分子生物学领域。本专利技术涉及用于从RNA模板产生核酸并进一步进行核酸复制的新型组合物、方法和试剂盒。特别地，本专利技术涉及通过反转录酶-聚合酶链反应来产生并扩增核酸。【专利说明】包含阴离子聚合物的RT-PCR用组合物和方法
本专利技术属于分子生物学领域。本专利技术涉及用于从RNA模板产生核酸并进一步进行核酸复制的新型组合物、方法和试剂盒。特别地，本专利技术涉及通过反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)产生并扩增核酸。
技术介绍
核酸的检测、分析、转录和扩增是现代分子生物学中最重要的步骤。将这种步骤应用于RNA分析在研究基因表达、诊断传染原或遗传疾病、产生cDNA和分析反转录病毒等应用中是特别重要的。反转录RNA，之后进行聚合酶链反应扩增，通常称作RT-PCR，已经广泛用于RNA的检测并定量。 所述RT-PCR步骤涉及两种单独的分子合成:第一，从RNA模板合成cDNA ;第二，通过PCR扩增对新合成的cDNA进行复制。可以在三个通用试验方法下实施RT-PCR:I)未偶联的RT-PCR，也称作两步RT-PCR。2)单种酶偶联的RT-PCR，也称作一步RT-PCR或连续RT-PCR，其中将单种聚合酶用于从RNA产生cDNA和之后的DNA扩增两者。3)两种(或更多种)酶偶联的RT-PCR，其中将至少两种单独的聚合酶用于最初的cDNA合成和之后的扩增。有时也将这称作一步RT-PCR或者一管RT-PCR。在未偶联的RT-PCR中，使用对于反转录酶活性最佳的缓冲液和反应条件作为独立步骤实施反转录。在cDNA合成之后，在对于PCR扩增最佳的条件下将小份的RT反应产物用作利用热稳定DNA聚合酶例如Taq DNA聚合酶进行PCR扩增的模板。在偶联的RT-PCR中，将反转录和PCR扩增组合于单种反应混合物中。单种酶RT-PCR利用特异性DNA聚合酶例如Tth DNA聚合酶的反转录酶活性，而两种酶的RT-PCR通常使用反转录病毒或细菌反转录酶(例如AMV-RT、MMLV-RT, HIV-RT, EIAV-RT, RAV2-RT、生氢氧化碳嗜热菌DNA聚合酶(C.hydrogenoformans DNA polymerase)或其突变体、变异体或衍生物)和热稳定的DNA聚合酶(例如Taq、Tbr、Tih、Tf1、Tfl、Pfu、Pwo、Kod、VENT?、DEEPVENT?、Tma、Tne、Bst、Pho, Sac、Sso、ES4 等或其突变体、变异体或衍生物)。偶联的RT-PCR相对于未偶联的RT-PCR提供了很多优点。偶联的RT-PCR比未偶联的RT-PCR需要更少地对反应混合物试剂和核酸产物进行处理(例如在两个反应步骤之间打开反应管以添加组分或酶)，因此较少的劳动密集和耗时，且降低污染的风险。此外，偶联的RT-PCR还要求较少的试样，使其特别适用于其中限制试样量的应用(例如在FFPEdg组织检查、环境试样的情况下)。尽管单种酶偶联的RT-PCR易于实施，然而由于需要的DNA聚合酶的量，因此这种体系实施起来昂贵。另外已经发现，单种酶偶联的RT-PCR法比未偶联的RT-PCR更不敏感，并限制为对长度小于一千碱基对的核酸进行聚合。即使当在单一反应混合物中偶联时，具有两种或更多种酶的偶联RT-PCR体系仍通常比单种酶体系显示提高的敏感性。与DNA聚合酶的反转录酶活性相比，这种效果有助于更高的反转录酶效率(SelIner和Turbett,BioTechniques (生物技术)25 (2):230-234 (1998))。尽管两种酶偶联的RT-PCR体系比单种酶体系更敏感，但是已经发现在cDNA复制期间反转录酶直接干扰DNA聚合酶，由此降低该技术的敏感性和效率(Sellner等人，J.Virol.Methods40:255-264 (1992))。为了克服反转录酶对DNA聚合酶的抑制活性，已经尝试了多种方案，包括:提高模板RNA的量，提高DNA聚合酶对反转录酶的比例，添加可以降低反转录酶对DNA聚合酶的抑制效果的改性试剂(例如非同源tRNA、T4基因32蛋白质、含硫或乙酸酯的分子)，以及在添加DNA聚合酶之前使反转录酶热失活。Sellner 等人(Nucleic Acids Research (核酸研究)20 (7): 1487-1490)描述通过聚合酶链反应检测病毒RNA要求预先反转录病毒RNA。为了最小化对大量试样进行处理所需要的手动操作次数，Sellner等人尝试设计了一种体系，由此可将反转录和扩增都需要的所有试剂都添加到一个管并可实施单个、不间断的热循环程序。在尝试利用Taq聚合酶和鸟成肌细胞(myoblastis)病毒建立这种一管体系时，他们注意到，检测病毒RNA的灵敏度明显下降。他们发现，反转录酶直接干扰Taq聚合酶。然而，所有这些改进的RT-PCR法都具有明显的缺点。在仅可获得有限量的试样的情况中，提高模板RNA的量是不可行的。单独优化反转录酶对DNA聚合酶之比对于一步RT-PCR的易使用试剂盒是不切实际的。目前提出的改性试剂用于减轻DNA聚合的反转录酶抑制的净效果存在争议并处于争论中:因这些试剂造成的正面影响非常取决于RNA模板的量、RNA的组成,或可能要求特定的反转录酶-DNA聚合酶的组合(Chandler等人,Appl.andEnvironm.Microbiol.64(2):669-677( 1998))。最后，在添加DNA聚合酶之前反转录酶的热失活否定了偶联RT-PCR的优势并带来了之前所讨论未偶联RT-PCR体系的所有劣势。即使反转录酶热失活，同样是因为热失活的反转录酶结合到cDNA模板，因此其仍可能对于PCR产生抑制效 果。为了降低反转录酶对聚合酶活性的抑制影响，已经完成了一些改进。在US2009/0137008A1中，Gong和Wang描述，通过以非特异性方式结合dsDNA的蛋白质例如Sso7d、Sac7d、Sac7e或Sso7e、通过磺酸和通过磺酸盐降低反转录酶对DNA聚合酶的抑制影响。在EP 1050587 BI中，Missel等人描述，通过均聚的核酸降低反转录酶对DNA聚合酶的抑制影响。尽管分别通过Gong和Wang以及Missel等人所述的方法已经成功地显示了反转录酶抑制影响的明显下降，但是在本领域中仍需要通过更加高效地降低反转录酶的抑制影响来进一步提高RT-PCR的特异性和灵敏度。因为RT-PCR应用的重要性，处于产生的易使用组合物形式中并展示高特异性和灵敏度的偶联RT-PCR体系要求少量的初始试样，降低从业者操作的数量，最小化污染的风险，最小化试剂的费用，不受使用的特定反应缓冲液的限制，并最大化本领域中需要的核酸终产物的量。专利技术概述本专利技术涉及用于从RNA模板产生核酸并进一步进行核酸复制的新型组合物和方法。具体地，本专利技术涉及在不是核酸的阴离子聚合物的存在下利用两种或更多种不同聚合酶通过反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)产生和扩增核酸。阴离子聚合物的存在用于抵消DNA聚合酶的抑制，其是在使用包含两种或更多种聚合酶且其至少一种具有反转录酶活性的组合物时发生的。本专利技术的组合物和方法用于产生和复制与RNA模板一部分互补的DNA分子。本专利技术一般涉及能够用于从RNA模板产本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适用于从RNA模板产生核酸的组合物，所述组合物包含不是核酸的阴离子聚合物，一种或多种寡核苷酸引物，任何一种或多种核苷酸或其衍生物，以及两种或更多种不同的聚合酶，其至少一种具有反转录酶活性且其至少一种具有核酸聚合酶活性。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：方楠，安德烈亚斯·米塞尔，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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