本发明专利技术公开了一种检测超氧阴离子自由基含量的方法。首先合成了噻吩-2-甲醛缩L-半胱氨酸席夫碱，利用水相合成法制备了β-巯基乙胺（CA）稳定的CdTe量子点，利用合成的噻吩-2-甲醛缩L-半胱氨酸席夫碱对CA-CdTe量子点进行修饰，制得一种检测超氧阴离子自由基的荧光探针，检测条件下，CA-CdTe量子点修饰了噻吩-2-甲醛缩L-半胱氨酸席夫碱后，其荧光强度有显著降低，而加入了超氧阴离子自由基后荧光强度有明显增加，超氧阴离子自由基浓度在0–1.0×10-4mol/L呈线性关系。本发明专利技术对超氧阴离子自由基浓度的检测具有较高的选择性和稳定性。
【技术实现步骤摘要】
一种检测超氧阴离子自由基含量的方法
本专利技术涉及一种利用荧光光度法快速检测超氧阴离子自由基的方法，特别是利用噻吩-2-甲醛缩L-半胱氨酸席夫碱修饰CdTe量子点作为荧光探针检测超氧阴离子自由基含量方法。
技术介绍
超氧阴离子自由基是生物体内重要的自由基之一，也是所有活性氧自由基的前体，可以转化为其它的活性自由基。超氧阴离子自由基与生物体发生的炎症、衰老及癌症等重大疾病有密切关系，因此对其检测具有非常重要的科学意义。目前，用于检测超氧阴离子自由基的方法包括电子顺磁共振法、SOD酶活性测定法、高效液相色谱、化学发光法、荧光分析法以及电化学方法等。在上述方法中，荧光分析法相比较而言更加具有吸引力，不仅简单易行，便于操作，具有高灵敏度、高选择性的特点，而且可以实现活细胞内超氧阴离子自由基的“原位可视化”，从而对它们在生命体内进行“实时在线”观测。本专利技术合成了噻吩-2-甲醛缩L-半胱氨酸席夫碱配体，利用该分子结构中的羧基对β-巯基乙胺（CA）稳定的CdTe量子点进行表面修饰，将其作为CA-CdTe量子点和超氧阴离子自由基的空间间隔物质，导致量子点荧光强度降低，在加入超氧阴离子自由基后，量子点荧光强度又有了显著增强，据此建立噻吩-2-甲醛席夫碱修饰CdTe量子点荧光探针检测超氧阴离子自由基浓度的高灵敏度荧光分析方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测超氧阴离子自由基含量的方法。检测超氧阴离子自由基含量原理是基于量子点与修饰物之间的空间间隔对量子点的荧光强度的影响。较长的间隔导致荧光强度增加而较短间隔导致荧光淬灭。CA-CdTe量子点在检测条件下具有较强的荧光强度，用噻吩-2-甲醛席夫碱修饰后，形成QDs-席夫纳米复合体系，由于空间间隔作用，使得体系荧光强度降低。而在QDs-席夫纳米复合物中加入不同浓度的超氧阴离子自由基后，由于增加了体系的空间间隔，荧光强度有了不同程度的增加，且呈正相关。因此，用噻吩-2-甲醛席夫碱修饰CA-CdTe量子点为荧光探针，通过测得不同浓度的超氧阴离子自由基的荧光强度值，建立了一种新的超氧阴离子自由基的检测手段。在现有的QDs-席夫碱-O2-体系中加入多种可能对体系荧光强度有较大影响的干扰物质（8-羟基喹啉、高氯酸锂、亚硝酸钠、硝酸钾、L-半胱氨酸、β-巯基乙胺），用于探究QDs-席夫纳米荧光探针的选择性。结果表明，当干扰离子浓度为1×10-3mol/L，超氧阴离子浓度为3.3×10-6mol/L，控制测定荧光强度的可允许误差为±5.0%，干扰离子对QDs-席夫碱-O2-体系的荧光强度影响很小，与空白对照相比，荧光强度几乎保持一致，没有太大的变化。也就是说，当这些干扰物质加入QDs-席夫碱-O2-体系中时，荧光没有受到影响。也就意味着在样品中，可以明显区别超氧阴离子自由基和其它物质，不会受到干扰。因此可以得出结论，所制备的QDs-席夫纳米探针对超氧阴离子具有很高的选择性和稳定性。本专利技术的具体步骤为：（1）称取0.02gNaOH固体溶于1mL超纯水中，配制成浓度为0.5mol/L的NaOH溶液；（2）将100μL步骤（1）配好的NaOH溶液，滴加到10mL分析纯二甲基亚砜中，配成5mmol/LNaOH的二甲基亚砜溶液，溶液中的含水量体积百分比为1%；磁力搅拌下与空气反应30分钟，制得超氧阴离子自由基，密封待用，超氧阴离子自由基的浓度通过朗伯比尔定律计算得出，其中在分析纯二甲基亚砜中的摩尔吸收系数为20.061（mol/L）-1cm-1（波长为271nm），再根据需要，用分析纯二甲基亚砜稀释成不同浓度的超氧阴离子自由基溶液；（3）将20mL超纯水和0.242gL-半胱氨酸倒入三口瓶中；（4）将10mL无水乙醇和0.224g噻吩-2-甲醛混合；（5）磁力搅拌下在步骤（3）所得溶液中缓慢滴加步骤（4）所得溶液，25℃水浴条件下磁力搅拌反应12小时，有土黄色沉淀缓慢生成，过滤，沉淀用超纯水洗涤2-3次，得到噻吩-2-甲醛缩L-半胱氨酸席夫碱，干燥待用；（6）在装有100mL超纯水的三口瓶中混合0.2284gCdCl2·H2O和0.2315gβ-巯基乙胺（CA），通入氮气，磁力搅拌升温至200℃，加入0.0798gTeO2和0.027gKBH4，溶液变色后，迅速取出，冷却，获得CA-CdTe量子点溶液，密封，3℃下保存；（7）将0.04g步骤（5）制得的噻吩-2-甲醛缩L-半胱氨酸席夫碱溶于30mL分析纯N,N-二甲基甲酰胺中，用分析纯三乙胺调pH=9，转入三口瓶中，搅拌下加入0.049gN-羟基丁二酰胺，30分钟后加入0.04gN,N’-二环己基碳二亚胺，25℃下活化24小时，加入6mL步骤（6）所得的CA-CdTe量子点溶液，继续反应24小时，以保证CA-CdTe量子点与噻吩-2-甲醛缩L-半胱氨酸席夫碱的稳定结合，获得CA-CdTe-席夫碱复合体系，将CA-CdTe-席夫碱复合体系在85℃下旋转蒸发，回收底液，冷却后，加入等体积的无水乙醇，阴凉条件下放置12小时，有CA-CdTe-席夫碱复合物从溶液中沉淀析出，再用无水乙醇进一步洗涤以除去未反应的CdTe量子点和席夫碱，再次旋转蒸发，回收底液，离心，干燥得到CA-CdTe-席夫碱复合物固体。（8）将步骤（7）制得的CA-CdTe-席夫碱复合物固体溶解在3mL分析纯N,N-二甲基甲酰胺中，取0.9mL该溶液,分别加入步骤（2）配制好的不同浓度的超氧阴离子自由基各0.1mL，最后分别用分析纯N,N-二甲基甲酰胺稀释成10mL溶液，再分别超声波分散15分钟，再分别将混合物平衡30分钟后进行荧光测试，测试条件为激发和发射狭缝均设为5nm，激发波长为303nm，发射波长为610.4nm，在室温下进行，结果表明，随着超氧阴离子自由基浓度的增加，CA-CdTe-席夫碱复合体系的荧光强度有显著的增加，超氧阴离子自由基浓度在0-1.0×10-4mol/L呈线性关系，线性方程为y=552.29χ+4958.7，其中：y为荧光值，χ为超氧阴离子自由基浓度，相关系数R=0.9615，检出限为1.8×10-6mol/L。（9）将步骤（7）所得的CA-CdTe-席夫碱复合物固体溶解在3mL分析纯N,N-二甲基甲酰胺中，取0.9mL该溶液,加入到0.1mL超氧阴离子自由基浓度为0-1.0×10-4mol/L的待测样品中，最后分别用分析纯N,N-二甲基甲酰胺稀释成10mL溶液，分别超声波分散15分钟，再分别将混合物平衡30分钟后进行荧光测试，测试条件下为激发和发射狭缝均设为5nm，激发波长为303nm，发射波长为610.4nm，在室温下进行荧光强度，并代入线性方程为y=552.29χ+4958.7计算待测样品中超氧阴离子自由基浓度，计算相对误差。本专利技术对超氧阴离子自由基浓度的检测具有较高的选择性和稳定性。附图说明图1为本专利技术的工作曲线图。图2为本专利技术噻吩-2-甲醛缩L-半胱氨酸席夫碱荧光光谱图。图3为本专利技术CA-CdTe量子点的荧光光谱图。图4为本专利技术CA-CdTe量子点(a)与QDs-席夫碱纳米复合物(b-g)的荧光光谱图。图5为本专利技术加入不同浓度的超氧阴离子自由基后QDs—席夫碱-O2-体系的荧光图谱。具体实施方式实施例：（1）称取0.02gNaOH固体本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测超氧阴离子自由基含量方法，其特征在于具体步骤为：（1）称取0.02g NaOH固体溶于1mL超纯水中，配制成浓度为0.5mol/L的NaOH溶液；（2）将100μL步骤（1）配好的NaOH溶液，滴加到10mL分析纯二甲基亚砜中，配成5mmol/L NaOH的二甲基亚砜溶液，溶液中的含水量体积百分比为1%；磁力搅拌下与空气反应30分钟，制得超氧阴离子自由基，密封待用，超氧阴离子自由基的浓度通过朗伯比尔定律计算得出，其中在分析纯二甲基亚砜中的摩尔吸收系数为20.061（mol/L）‑1 cm‑1 ，波长为271nm，再根据需要，用分析纯二甲基亚砜稀释成不同浓度的超氧阴离子自由基溶液；（3）将20mL超纯水和0.242 g L‑半胱氨酸倒入三口瓶中；（4）将10mL无水乙醇和0.224g噻吩‑2‑甲醛混合；（5）磁力搅拌下在步骤（3）所得溶液中缓慢滴加步骤（4）所得溶液，25℃水浴条件下磁力搅拌反应12小时，有土黄色沉淀缓慢生成，过滤，沉淀用超纯水洗涤2‑3次，得到噻吩‑2‑甲醛缩L‑半胱氨酸席夫碱，干燥待用；（6）在装有100mL超纯水的三口瓶中混合0.2284g CdCl2·H2O和0.2315gβ‑巯基乙胺，通入氮气，磁力搅拌升温至200℃，加入0.0798g TeO2和0.027g KBH4，溶液变色后，迅速取出，冷却，获得CA‑CdTe量子点溶液，密封，3℃下保存；（7）将0.04g步骤（5）制得的噻吩‑2‑甲醛缩L‑半胱氨酸席夫碱溶于30mL分析纯 N,N‑二甲基甲酰胺中，用分析纯三乙胺调pH = 9，转入三口瓶中，搅拌下加入0.049g N‑羟基丁二酰胺，30分钟后加入0.04g N,N’‑二环己基碳二亚胺，25℃下活化24小时，加入6mL步骤（6）所得的CA‑CdTe量子点溶液，继续反应24小时，以保证CA‑CdTe量子点与噻吩‑2‑甲醛缩L‑半胱氨酸席夫碱的稳定结合，获得CA‑CdTe‑席夫碱复合体系，将CA‑CdTe‑Schiff复合体系在85℃下旋转蒸发，回收底液，冷却后，加入等体积的无水乙醇，阴凉条件下放置12小时，有CA‑CdTe‑席夫碱复合物从溶液中沉淀析出，再用无水乙醇进一步洗涤以除去未反应的CdTe量子点和席夫碱，再次旋转蒸发，回收底液，离心，干燥得到CA‑CdTe‑席夫碱复合物固体；（8）将步骤（7）制得的CA‑CdTe‑席夫碱复合物固体溶解在3mL分析纯N,N‑二甲基甲酰胺中，取0.9mL该溶液,分别加入步骤（2）配制好的不同浓度的超氧阴离子自由基各0.1mL，最后分别用分析纯N,N‑二甲基甲酰胺稀释成10mL溶液，再分别超声波分散15分钟，再分别将混合物平衡30分钟后进行荧光测试，测试条件为激发和发射狭缝均设为5nm，激发波长为303nm，发射波长为610.4nm，在室温下进行，结果表明，随着超氧阴离子自由基浓度的增加，CA‑CdTe‑席夫碱复合体系的荧光强度有显著的增加，超氧阴离子自由基浓度在0‑1.0×10‑4mol/L呈线性关系，线性方程为y = 552.29χ+ 4958.7，其中：y为荧光值，χ为超氧阴离子自由基浓度，相关系数R=0.9615，检出限为1.8×10‑6mol/L；（9）将步骤（7）所得的CA‑CdTe‑席夫碱复合物固体溶解在3mL分析纯N,N‑二甲基甲酰胺中，取0.9mL该溶液,加入到0.1mL超氧阴离子自由基浓度为0‑1.0×10‑4mol/L的待测样品中，最后分别用分析纯N,N‑二甲基甲酰胺稀释成10mL溶液，分别超声波分散15分钟，再分别将混合物平衡30分钟后进行荧光测试，测试条件下为激发和发射狭缝均设为5nm，激发波长为303nm，发射波长为610.4nm，在室温下进行荧光强度，并代入线性方程为y = 552.29χ+ 4958.7计算待测样品中超氧阴离子自由基浓度，计算相对误差。...
【技术特征摘要】
1.一种检测超氧阴离子自由基含量方法，其特征在于具体步骤为：（1）称取0.02gNaOH固体溶于1mL超纯水中，配制成浓度为0.5mol/L的NaOH溶液；（2）将100μL步骤（1）配好的NaOH溶液，滴加到10mL分析纯二甲基亚砜中，配成5mmol/LNaOH的二甲基亚砜溶液，溶液中的含水量体积百分比为1%；磁力搅拌下与空气反应30分钟，制得超氧阴离子自由基，密封待用，超氧阴离子自由基的浓度通过朗伯比尔定律计算得出，其中在分析纯二甲基亚砜中的摩尔吸收系数为20.061（mol/L）-1cm-1，波长为271nm，再根据需要，用分析纯二甲基亚砜稀释成不同浓度的超氧阴离子自由基溶液；（3）将20mL超纯水和0.242gL-半胱氨酸倒入三口瓶中；（4）将10mL无水乙醇和0.224g噻吩-2-甲醛混合；（5）磁力搅拌下在步骤（3）所得溶液中缓慢滴加步骤（4）所得溶液，25℃水浴条件下磁力搅拌反应12小时，有土黄色沉淀缓慢生成，过滤，沉淀用超纯水洗涤2-3次，得到噻吩-2-甲醛缩L-半胱氨酸席夫碱，干燥待用；（6）在装有100mL超纯水的三口瓶中混合0.2284gCdCl2·H2O和0.2315gβ-巯基乙胺，通入氮气，磁力搅拌升温至200℃，加入0.0798gTeO2和0.027gKBH4，溶液变色后，迅速取出，冷却，获得CA-CdTe量子点溶液，密封，3℃下保存；（7）将0.04g步骤（5）制得的噻吩-2-甲醛缩L-半胱氨酸席夫碱溶于30mL分析纯N,N-二甲基甲酰胺中，用分析纯三乙胺调pH=9，转入三口瓶中，搅拌下加入0.049gN-羟基丁二酰胺，30分钟后加入0.04gN,N’-二环己基碳二亚胺，25℃下活化24小时，加入6mL步骤（6）所得的CA-CdTe量子点溶液，继续反应24小时，以保证CA-CdTe量子点与噻吩-2-甲醛缩L-半胱氨酸席夫碱的稳定结合，获得CA-CdTe-席夫碱复合体系，将CA-CdTe-Schiff复合体系在85℃下旋转蒸发，回收底液，冷却后...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘峥，李巍，魏席，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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