一种功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与应用。该功能化温度敏感型聚合物的结构式如式Ⅰ所示，其制备方法包括如下步骤：在引发剂存在的条件下，温敏单体和功能单体经自由基聚合反应得到温度敏感型聚合物；温度敏感型聚合物与水合肼经酰肼化反应得到酰肼修饰的温度敏感型聚合物；酰肼修饰的温度敏感型聚合物与2‑(二苯基磷基)对苯二甲酸‑1,1‑甲基‑4‑五氟苯基酯经反应即得。本发明专利技术对叠氮标记O‑GlcNAc修饰蛋白质的富集原理是基于叠氮与三苯基磷间的施陶丁格连接反应，此反应生物正交性强，在水溶液中产率高、专一且稳定，同时不需要催化剂从而与后续质谱鉴定具有良好的相容性，该方法大幅度提高了混合样品中低丰度O‑GlcNAc修饰蛋白质谱鉴定的氨基酸序列覆盖率。

Functional temperature sensitive polymer, preparation method and application thereof

The invention discloses a functional temperature sensitive polymer, a preparation method and an application thereof. The functional structure of temperature sensitive polymers such as formula I, the preparation method comprises the following steps: in the presence of initiators, temperature sensitive monomer and functional monomer by free radical polymerization reaction to obtain the temperature sensitive polymer; temperature sensitive polymer by hydrazine and hydrazine hydrate reaction temperature sensitive polymer hydrazide modified; temperature sensitive polymer hydrazide modified with 2 (two phenyl phosphate) 1,1 4 terephthalic acid methyl five fluorine phenyl ester was that by reaction. The enrichment principle of the invention of azide labeled O GlcNAc modified proteins are Staudinger ligation reaction of azide and three phenyl phosphorus based on the reaction of bioorthogonal, in aqueous solution of high yield, specificity and stability, and thus needs no catalysts and subsequent mass spectrometry has good compatibility, the the method greatly improves the amino acid sequence of mixed samples of low abundance O GlcNAc modified protein identification coverage.

【技术实现步骤摘要】
一种功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与应用，属于分析化学领域。
技术介绍
O-连接的β-N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)是一种广泛存在于真核细胞中的翻译后修饰。与经典的O-糖基化修饰有所不同，O-GlcNAc糖基化修饰仅存在于细胞核和细胞质蛋白质，只有一个单糖结构，结构简单，是一种高度动态、可诱导且可逆的修饰方式。尽管蛋白质上的这种修饰丰度极低，但O-GlcNAc修饰蛋白质在生物体内扮演着重要角色，从基因转录到信号转导和细胞周期的调控等都有着O-GlcNAc糖基化修饰蛋白质的参与。研究表明蛋白质上O-GlcNAc糖基化修饰水平异常与许多人类疾病如神经退行性疾病、代谢类疾病及癌症等密切相关。鉴于此，对O-GlcNAc修饰蛋白质进行深度鉴定对疾病的发生发展、疾病诊断标志物的发现及治疗靶标有着深远意义。然而由于O-GlcNAc糖基化修饰处于极低的化学计量水平且O-GlcNAc糖苷键易断裂，对其鉴定手段提出了严峻的挑战。为了提高质谱鉴定灵敏度，在质谱鉴定前在复杂生物样品中对O-GlcNAc糖基化修饰蛋白质进行富集是必要步骤。近年来国内外发展了针对O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集方法有：凝集素富集法、抗体富集法、酰肼富集法和代谢标签富集法等。凝集素是一种可以与某种特殊结构单糖或聚糖结合的糖蛋白，因此可利用凝集素与糖链间的亲和作用富集糖蛋白/糖肽。但其亲和力不足、选择性有限且偏爱簇生的GlcNAc修饰，因此富集效率低。抗体富集法是基于抗体抗原的特异性结合进行选择性富集。目前已商业化的O-GlcNAc修饰的抗体中使用较多的是RL2和CTD110.6，此方法的特异性和富集效率都强于凝集素富集法，但抗体存在底物氨基酸序列依赖性且制备周期长、价格昂贵而难以广谱性富集所有的O-GlcNAc修饰蛋白/肽段。酰肼富集法是利用氧化剂将O-GlcNAc糖链上相邻的两个羟基氧化形成醛基再利用其与带有酰肼基团的固相载体共价结合选择性富集O-GlcNAc修饰蛋白/肽段，但此方法需要进行多步化学反应，且氧化后糖链开环使得糖链结构不能完整保留，影响下游对糖链的结构解析。代谢标签富集法通过细胞代谢标记在O-GlcNAc修饰上引入叠氮等修饰基团再利用生物正交反应选择性富集O-GlcNAc修饰蛋白/肽段。此外，现有O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集载体均为固相材料，在富集时与溶液中的靶分子蛋白形成异相体系，固液界面间的传质阻力和固相材料与目标蛋白间的空间位阻等因素都会降低富集反应速率和效率。因此需要提供一种新的富集O-GlcNAc修饰蛋白/肽段的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与应用，本专利技术通过自由基聚合反应和化学修饰的方式(三苯基磷基团修饰)制备得到功能化温度敏感型聚合物，能够实现选择性富集、分离O-GlcNAc修饰蛋白质，然后即可利用质谱技术分析鉴定O-GlcNAc修饰蛋白样品。本专利技术所提供的功能化温度敏感型聚合物，其结构式如式Ⅰ所示：式Ⅰ中，m为40～280之间的数，n为140～850之间的数。所述功能化温度敏感型聚合物的数均分子量可为20000～120000，优选50000～60000。式Ⅰ中，m优选为110～140之间的数，n优选为350～420之间的数。所述功能化温度敏感型聚合物的数均分子量可为。本专利技术进一步提供了所述功能化温度敏感型聚合物的制备方法，是以N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和丙烯酸甲酯(MA)分别为温敏单体和功能单体，水合肼(HydrazineHydrate)和施陶丁格试剂2-(二苯基磷基)对苯二甲酸-1,1-甲基-4-五氟苯基酯(2-(Diphenylphosphino)terephthalicacid1-methyl4-pentafluorophenyldiester，phosphine-PFPester)为功能基团修饰试剂；经自由基聚合反应得到温度敏感型聚合物后，依次加入两种功能基团修饰试剂，对所得温度敏感型聚合物共价修饰，生成带有大量三苯基磷基团的温度敏感型聚合物，也即所述功能化温度敏感型聚合物。具体包括如下步骤：(1)在引发剂存在的条件下，温敏单体和功能单体经自由基聚合反应得到温度敏感型聚合物；所述温度敏感型聚合物同时带有温度响应基团以及能与水合肼酰肼化的羧基基团；所述温敏单体为N-异丙基丙烯酰胺；所述功能单体为丙烯酸甲酯或丙烯酸；(2)所述温度敏感型聚合物与水合肼经酰肼化反应得到酰肼修饰的温度敏感型聚合物；(3)所述酰肼修饰的温度敏感型聚合物与2-(二苯基磷基)对苯二甲酸-1,1-甲基-4-五氟苯基酯经反应即得所述功能化温度敏感型聚合物。上述的制备方法中，步骤(1)中，所述温敏单体与所述功能单体的摩尔比可为1：4～4：1，具体可为4：1；所述引发剂可为过硫酸钾、过硫酸铵和过硫酸钠中任一种；所述引发剂的用量可为所述温敏单体质量的5％～50％，具体可为10％；所述自由基聚合反应的温度可为50～75℃，具体可为60℃，时间可为8～12小时，具体可为8h；所述自由基聚合反应在水与甲醇或异丙醇的混合液中进行；所述自由基聚合反应在惰性气氛中进行，如氮气或氩气气氛。上述的制备方法中，步骤(2)中，所述水合肼与所述温度敏感型聚合物的摩尔比可为8：1～2：1，具体可为6：1；在冰浴条件下将所述温度敏感型聚合物与所述水合肼混合；所述酰肼化反应的温度可为20～25℃，时间可为2～6小时，具体可为5小时；所述酰肼化反应在水与甲醇或异丙醇的混合液中进行；所述酰肼化反应在惰性气氛中进行，如氮气或氩气气氛。上述的制备方法中，步骤(3)对所述酰肼修饰的温度敏感型聚合物进行三苯基磷修饰；所述酰肼修饰的温度敏感型聚合物与所述2-(二苯基磷基)对苯二甲酸-1,1-甲基-4-五氟苯基酯的质量比可为1：2～2：1，具体可为2：1；所述反应的温度可为20～25℃，时间可为24～48小时，具体可为48小时；所述反应在水与N,N-二甲基甲酰肼或二甲基亚砜的混合液中进行。本专利技术提供的上述制备方法基于如下原理：首先在引发剂存在下将温敏单体和功能单体通过自由基聚合反应得到温度敏感型聚合物；之后通过酰肼化反应将水合肼共价修饰于温度敏感型聚合物，达到设定反应时间后通过透析去除残留反应物；之后加入施陶丁格试剂与酰肼修饰的温度敏感型聚合物混合均匀继续反应，达到设定反应时间后通过透析去除残留反应物并进行冻干去除溶剂，得到三苯基磷修饰的温度敏感型聚合物，即功能化温度敏感型聚合物。本专利技术提供的功能化温度敏感型聚合物可通过三苯基磷与叠氮基团之间高度特异性和生物正交的施陶丁格连接反应，对叠氮标记的O-GlcNAc修饰蛋白进行选择性富集，并利用此聚合物的温度响应特性，在富集时完全溶解实现均相反应富集，在回收时沉淀析出实现异相分离。富集所得的O-GlcNAc修饰蛋白可直接进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，也可酶解得到肽段后将样品点在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪靶上，或进样到液-质联用系统中进行分析。将本专利技术功能化温度敏感型聚合物用于O-GlcNAc修饰蛋白富集和/或分离时，可按照如下步骤进行：将含有O-GlcNAc修饰蛋白的样品与所述功能化温度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种功能化温度敏感型聚合物，其结构式如式Ⅰ所示：

【技术特征摘要】
1.一种功能化温度敏感型聚合物，其结构式如式Ⅰ所示：式Ⅰ中，m为40～280之间的数，n为140～850之间的数。2.权利要求1所述功能化温度敏感型聚合物的制备方法，包括如下步骤：(1)在引发剂存在的条件下，温敏单体和功能单体经自由基聚合反应得到温度敏感型聚合物；所述温敏单体为N-异丙基丙烯酰胺；所述功能单体为丙烯酸甲酯或丙烯酸；(2)所述温度敏感型聚合物与水合肼经酰肼化反应得到酰肼修饰的温度敏感型聚合物；(3)所述酰肼修饰的温度敏感型聚合物与2-(二苯基磷基)对苯二甲酸-1,1-甲基-4-五氟苯基酯经反应即得所述功能化温度敏感型聚合物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述温敏单体与所述功能单体的摩尔比为1：4～4：1；所述引发剂的用量为所述温敏单体质量的5％～50％；所述自由基聚合反应的温度为50～75℃，时间为8～12小时；所述自由基聚合反应在水与甲醇或异丙醇的混合液中进行。4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述水合肼与所述温度敏感型聚合物的摩尔比为8：1～2：1在冰浴条件下将所述温度敏感型聚合物与所述水合肼混合；所述酰肼化反应的温度为20～25℃，时间为2～6小时；所述酰肼化反应在水与甲醇或异丙醇的混合液中进行。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱小红，秦伟捷，张万军，刘彤，
申请(专利权)人：北京蛋白质组研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11