用番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法技术

一种番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，由番茄prosystemin基因克隆、构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体、制备含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的根癌农杆菌菌株、制备转基因丹参植株步骤组成。将番茄prosystemin基因转入丹参植株，干涉了丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因，抗虫性明显高于野生丹参，生长100天转基因的丹参根中，迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮IIA含量，分别是同时期非转化丹参根中迷迭香酸和丹酚酸B和丹参酮IIA的1.31倍、1.69倍、2.62倍。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及到在丹参中引入并表达番茄原系统素基因的方法。
技术介绍
丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)为唇形科(Labiatae)鼠尾草属多年生草本植物，以其根及根茎入药，为我国常用大宗药材之一。丹参的主要活性成分为脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类，具有活血化瘀，通经止痛，清心除烦等功能，在临床上被广泛用于心脑血管疾病、癌症以及各种炎症的治疗。伴随着丹参原药材需求量的日益扩大和规范化种植的需求，培育活性成分含量高的优良丹参新品种已成为丹参原药材生产中亟待解决的关键问题之一。最初从丹参中分离出来的水溶性成分是丹参素，它能抗血小板聚集，具有抗血栓形成、促进纤维蛋白降解以及抗心肌缺血的功效。此外，丹酚酸也是丹参水溶性成分里面重要的一类，总丹酚酸不仅对心、脑、肝、肾等器官的损伤都有保护作用，其中丹酚酸B也作为目前已知抗氧化作用最强的天然产物之一，在体内发挥着清除自由基、提高机体抗氧化能力等重要生理作用。丹酚酸B也是《中华人民共和国药典》(2010年版)规定的丹参药材质量控制的水溶性指标性成分之一。丹参中代表性成分丹参酮IIA参本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，由下述步骤组成：(1)番茄prosystemin基因克隆用E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit提取试剂盒，按照说明书分离提取番茄总RNA，用PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒，按照说明书将番茄总RNA反转录成cDNA备用；采用Primer Premier5.0软件，设计番茄prosystemin基因编码框的上游引物、下游引物，以番茄cDNA为模板，进行聚合酶链式反应，反应体系为：取番茄cDNA与DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTP、上游引物、下游引物、二次蒸馏水的体积比为1：0.5：5：5...

【技术特征摘要】
1.一种用番茄基因和丹参内源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，由下述步骤组成: (1)番爺prosystemin基因克隆 用E.Z.N.A.? Plant RNA Kit提取试剂盒，按照说明书分离提取番茄总RNA，用PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒,按照说明书将番爺总RNA反转录成cDNA备用；采用Primer Premier5.0软件,设计番爺prosystemin基因编码框的上游引物、下游引物，以番茄cDNA为模板，进行聚合酶链式反应，反应体系为:取番茄cDNA与DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTP、上游引物、下游引物、二次蒸馏水的体积比为1:0.5:5:5:1:1:37.5，按照如下条件反应:95°C 3分钟，95°C 30秒、57°C 30秒、72°C 45秒、循环35次，得到番茄prosystemin基因，并在番爺prosystemin基因的上游引物前引入Spe I限制性酶切位点和保护碱基GACTAGT，在下游引物前引入BstE II限制性酶切位点和保护碱基CAGGGTAACC，用番爺prosystemin基因引物:上游引物 prosystemin-F5' -GACTAGTATGGGAACTCCTTCATATGATATC-3'下游引物 prosystemin-RS' -CAGGGTAACCCGTTTGTCTGTTATTATTTGAG-3' 以番茄cDNA为模板，按下述反应体系进行混合:番茄cDNA与DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTP、prosystemin-F、prosystemin-R、二次蒸懼水的体积比为 2:0.5:5:5:1:1:36.5，并按照 95 °C 3 分钟，95°C 30 秒、57°C 30 秒、72°C 45 秒、循环 35 次，进行聚合酶链式反应扩增，得含有酶切位点的番茄P r O S y S t e m i η基因，获得的扩增产物进行电泳分离，回收扩增产物与PMD19-T载体用T4DNA连接酶按连接酶使用说明书连接，构成prosystemin-pMD19-T载体，并采用热激转化法转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，prosystemin-pMD19-T载体与大肠杆菌DH5 α的体积比为1:9.5~10.5,挑选所得阳性克隆，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到番茄prosystemin基因序列，该基因序列如下: atgggaactc cttcatatga tatcaaaaac aaaggagatg acatgcaaga 50 agaaccaaag gtgaaacttc accatgagaa gggaggagat gaaaaggaaa 100 aaataattga aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaagatacc 150 atctcttcat atgttttaag agatgataca caagaaatac caaagatgga 200 acatgaggag ggaggatatg taaaggagaa aattgttgaa aaggagacta 250 tatcccaata tatcatcaag attgaaggag atgatgatgc acaagaaaaa 300 ctaaaggttg agtatgagga ggaagaatat gaaaaagaga aaatagttga 350 aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaaggagat gatgcacaag 400 aaaaaccaaa ggtggaacat gaggaaggag atgacaaaga gactccatca 450 caagatatca tcaagatgga aggggagggt gcactagaaa taacaaaggt 500 ggtatgtgag aaaattatag tacgagaaga tcttgGtgtt caatcaaaac 550 ctccatcaaa gcgtgatcct cccaaaatgc aaacagacaa taataaactc 600 (2)构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体 用Spe I和BstE II分别双酶切prosystemin-pMD19_T载体、植物表达载体pCAMBIA-1302，分别回收prosystemin基因片段和pCAMBIA_1302双酶切后的酶切产物，将片段与产物用T4DNA连接酶连接，筛选，获得pCAMBIA-1302-prosystemin中间载体； 选取位于丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因，简称C0MT，编码区3'端345bp的片段作为RNA干涉的靶片段，在该片段分别引入酶切位点Cla I/Kpn I及Xho I/BamH I，应用PrimerPrime5.0设计扩增引物:i COMT-F: 5' -CCATCGAT GGTACCACCCTCCCCGACGGCGGCGTCCA-3'i COMT-R: 5' -GCTCTAGACTCGAG GGATCCCACACCACCTACAACCACCTCCT-3'； 用聚合酶链式扩增反应，将该345bp的上游引入Cla I和Kpn I两个酶切位点，于其下游引入Xho I和BamH I两个酶切位点；经聚合酶链式扩增反应扩增，得含有Cla I/Kpn I及Xho I/BamH I 的产物 COMTi，连接 p_MD19T 载体得 C0MTi_pMD19T 载体；用 Xho I 和 Kpn I 分别酶切 C0MT1-pMD19T 载体、pKannibal 载体，将用 Xho 1、KpnI 酶切 C0MTi_pMD19T 载体的片段与经Xho 1、Kpn I酶切pKannibal载体的片段,用DNA连接酶相连成pKannibal+中间载体；用BamH I和Cla I分别酶切C0MTi_pMD19T载体、pKannibal+载体，用含有BamH I和Cla I酶切C0MT1-pMD19T载体的片段与经BamH I和Cla I酶切pKannibal+的片段用DNA连接酶相连，获得的新载体为pKANNIBAL/COMTi ； 用 Sac I...

【专利技术属性】
技术研发人员：王喆之，陈尘，张璇，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61