本发明专利技术属于生物技术领域，特别涉及一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法。本发明专利技术以简单异尖线虫第三期幼虫总RNA为模板，用RT-PCR的方法扩增得到500bp大小的特异片段，将扩增产物克隆至pMD18-T转化感受态菌DH5-α,经酶切鉴定获得阳性重组质粒，然后将重组质粒和表达载体pET-32a分别以BamHI和HindШ双酶切后构建重组表达载体pET-32a-Ani-s4，并将其转化入大肠杆菌BL21中，提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后，用IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测显示，融合蛋白的分子量约为25kDa，Ani s4基因在大肠杆菌中成功表达。同时所构建的表达蛋白具有的His-tag为其后的纯化工作提供了极大的便利。该ES抗原蛋白的成功表达，为后续的简单异尖线虫免疫学检测方法的研究奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，特别涉及。
技术介绍
排泄分泌抗原(ES抗原)是在寄生虫的感染过程中，由其口器和排泄孔分泌或排泄的抗原物质。线虫的ES系统有许多功能，包括渗透调节、离子调节及排泄、分泌等。分泌的物质在体外可以降解细胞基质，破坏宿主组织，引起临床的过敏反应，如麻疹和水肿。运用分子克隆技术获得纯化的重组寄生虫抗原，其有效性和特征性已经在许多寄生虫感染的诊断中得到了印证。这些合成的蛋白包括了寄生生活及感染过程中的分泌排泄抗原一 ES抗原。相关研究表明，简单异尖线虫三期幼虫可以侵入宿主的胃肠黏膜释放ES蛋白。Anis4是简单异尖线虫的一个抗原基因，相关研究结果显示，体外表达的该蛋白具有ES蛋白性质，其具有高度的耐热性，表达的抗原中不包含糖基化作用。该抗原蛋白经过长时间的加热，仍然能够识别在人体病原感染病例中的阳性血清样本，所以研究认为该蛋白与临床检测相关。在应用该抗原检测人体感染病例研究中，显示Ani s4表达抗原能与大部分病人血清产生特异反应。天然的ES蛋白获得具有非常大的难度，且国内尚无Ani s4基因体外表达的相关方法报道。鉴于Ani s4基因的抗原特性以及表达ES蛋白良好的免疫原性和保护效果，本专利技术研究对其进行克隆和表达，作为深入研究简单异尖线虫相关检测的工具。
技术实现思路
本专利技术提供。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是:，包括如下步骤:①简单异尖线虫总RNA的提取，②简单异尖线虫Ani s4抗原基因的RT-PCR扩增，根据Ani s4抗原基因其阅读框的序列特点，在序列的两端分别加上BamH I和Hind ΠΙ酶切位点设计引物，同时增加保护性碱基；设计的引物如下:上游引物5，一CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT—3，(SEQ ID N0.1),下游引物5’ 一CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA— 3’ (SEQ ID N0.2),以步骤①提取的总RNA为模板，反转录出单链cDNA，经PCR扩增，获得目的基因Anis4，③将纯化后的目的基因PCR产物和pMD18-T载体进行连接，获得重组质粒pMD18-T-Ani_s4 ； ④原核表达载体的构建和鉴定:BamH I和Hindm双酶切质粒pMD18-T-Ani_s4和质粒pET_32a，回收所需目的片段，加入T4DNA连接酶进行连接；将连接产物转化感受态细胞，抽提质粒；再应用质粒转化大肠杆菌，BamH I和Hindm双酶切筛选阳性克隆，命名为pET32a-Ani_s4 ；⑤IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白，含重组表达质粒的菌种活化后，将阳性菌接种到含Amp的LB液体培养基中，37°C振荡培养至菌液的OD值为0.5-0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为lmmol/L后34°C继续振荡培养进行诱导表达；诱导表达后通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达。作为优选，IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白的具体步骤如下:含重组表达质粒的菌种活化后，取Iml阳性菌接种到50mL含Amp的LB液体培养基中，于37°C摇床中以195rpm振摇培养，至菌液的OD值约为0.5-0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为lmmol/L后34°C继续振荡培养，分别在诱导前(Oh)和诱导后2、4、6、8h吸取2mL菌样于4°C，5000rpm离心5min，收集细菌沉淀，用PBS重悬洗涤2次，加入40 μ I的I X SDS上样缓冲液，煮沸7min，冰浴2min，12000rpm离心5分钟，同时设立带pET_32a质粒的BL21大肠杆菌对照；[0021 ] 同时，将剩余的40ml菌液用PBS洗2次，加ImL裂解缓冲液、10 μ I溶菌酶，将40ml菌液浓缩至4ml，超声波裂解浓缩菌液后12000rpm离心lmin，沉淀用PBS重悬加入40 μ I的I X SDS上样缓冲液，上清加入等量的2 X SDS上样缓冲液，煮沸5min，冰浴2min，_20°C备 用。作为优选，超声波裂解浓缩菌液的条件为200?，处理4s，间隔4s，共99次。作为优选，RT-PCR扩增的反应体系为:10XPCR buffer5 μ I, IOmM dNTPs4 μ I,ANCE-Upl μ 1，ANCE-Downl μ 1，cDNA2 μ 1，ddH2036.5μ l,5U/y I Taq 酶 0.5 μ 1，总体积 50.0 μ I ;扩增程序:94 0C 5min — 94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 72 °C lmin, 30 个循环—72°C IOmin。本专利技术对简单异尖线虫的Ani s4抗原基因进行了克隆和表达。根据已报道的简单异尖线虫的Ani s4抗原基因序列设计引物，以简单异尖线虫第三期幼虫总RNA为模板，用RT-PCR的方法扩增得到500bp大小的特异片段，将扩增产物克隆至PMD18-T转化感受态菌DH5-a，经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列比较，同源性为97.8%。然后将重组质粒和表达载体pET-32a分别以BamH I和Hindm双酶切后构建重组表达载体pET-32a-An1-s4，并将其转化入大肠杆菌BL21中，提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后，用IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测显示，融合蛋白的分子量约为25kDa，Ani s4基因在大肠杆菌中成功表达。同时所构建的表达蛋白具有的His-tag为其后的纯化工作提供了极大的便利。该ES抗原蛋白的成功表达，为后续的简单异尖线虫免疫学检测方法的研究奠定了基础。【附图说明】图1是Ani s4基因的RT-PCR扩增图，其中M.DNA Marker ;1.阴性对照；2.RT-PCR扩增产物；图2是pl8-T-An1-s4PCR及双酶切鉴定，其中M.DNA Marker ；1.阴性对照；2.重组质粒PCR鉴定；3.双酶切产物；图3是pl8-T-Ani_s4序列比对结果；图4是pET32a-Ani_s4重组质粒PCR及双酶切鉴定图，其中MDNA Marker; 1.阴性对照；2.DH5- α重组质粒PCR扩增产物；3.BL21重组质粒PCR扩增产物；4.pET32a-An1-s4BamH I 和 HindIII 双酶切产物；图5是pET32a-Ani_s4与公布序列比较图；图6是pET32a-Ani_s4与公布序列的有效作用蛋白氨基酸序列比较图谱；图7 是本专利技术 SDS-PAGE 图，其中 M.Protein Molecular weight Marker ；1.pET-32a 空载体 BL21 诱导 8 小时；2.pET32a_Ani_s4BL21 未诱导；3_6.pET32a_Ani_s4 分别诱导2，4，6，8小时的表达产物；图8 是本专利技术 Western-blot 图，其中 M.预染蛋白 Marker; 1.pET32a-Ani_s4BL21诱导8小时的表达产物。 【具体实施方式】下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本专利技术的实施并不局限于下面的实施例，对本专利技术所做的任何形式上的变通和/或改变本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种简单异尖线虫Ani s 4抗原基因的克隆和表达方法，其特征在于包括如下步骤：①简单异尖线虫总RNA的提取，②简单异尖线虫Ani s 4抗原基因的RT‑PCR扩增，根据Ani s 4抗原基因其阅读框的序列特点，在序列的两端分别加上BamHI和Hind Ш酶切位点设计引物，同时增加保护性碱基；设计的引物如下：上游引物5'—CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT—3' （SEQ ID NO.1），下游引物5'—CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA— 3' （SEQ ID NO.2），以步骤①提取的总RNA为模板，反转录出单链cDNA，经PCR扩增，获得目的基因Ani s 4，③将纯化后的目的基因PCR产物和pMD18‑T载体进行连接，获得重组质粒pMD18‑T‑Ani‑s4；④原核表达载体的构建和鉴定：BamHI和Hind Ш双酶切质粒pMD18‑T‑Ani‑s4和质粒pET‑32a，回收所需目的片段，加入T4 DNA连接酶进行连接；将连接产物转化感受态细胞，抽提质粒；再应用质粒转化大肠杆菌， BamH I和Hind Ш双酶切筛选阳性克隆，命名为pET32a‑Ani‑s4；⑤IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白，含重组表达质粒的菌种活化后，将阳性菌接种到含Amp的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至菌液的OD值为0.5‑0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L后34 ℃继续振荡培养进行诱导表达； 诱导表达后通过SDS‑PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成简单异尖线虫Ani s 4抗原基因的克隆和表达。...
【技术特征摘要】
1.一种简单异尖线虫Ani S 4抗原基因的克隆和表达方法，其特征在于包括如下步骤: ①简单异尖线虫总RNA的提取， ②简单异尖线虫Anis 4抗原基因的RT-PCR扩增， 根据Ani s 4抗原基因其阅读框的序列特点，在序列的两端分别加上及和历Π1酶切位点设计引物，同时增加保护性碱基；设计的引物如下:上游引物 5’一CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT — 3’ (SEQ ID N0.1), 下游引物 5’一CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA — 3’ (SEQ ID N0.2), 以步骤①提取的总RNA为模板，反转录出单链cDNA，经PCR扩增，获得目的基因Ani s4, ③将纯化后的目的基因PCR产物 和pMD18-T载体进行连接，获得重组质粒pMD18-T-Ani_s4 ； ④原核表达载体的构建和鉴定: BamHl取Hind似双酶切质粒pMD18-T-Ani_s4和质粒pET_32a，回收所需目的片段，加入T4 DNA连接酶进行连接；将连接产物转化感受态细胞，抽提质粒；再应用质粒转化大肠杆菌，BamH I細ind /Z/双酶切筛选阳性克隆，命名为pET32a-Ani_s4 ； ⑤IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白， 含重组表达质粒的菌种活化后，将阳性菌接种到含Amp的LB液体培养基中，37 V振荡培养至菌液的OD值为0.5-0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为I mmol/L后34 °C继续振荡培养进行诱导表达； 诱导表达后通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达。2.根据权利要求1所述的简单异尖线虫Anis 4抗原基因的克隆和表达方法，其特征在于IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李孝军，王素华，张明哲，杜爱芳，陈璐敏，周圆，洪青林，唐行忠，
申请(专利权)人：舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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