本发明专利技术提供了一种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液及其应用，其关键创新点为新发明专利技术的裂解液可直接用于植物寄生线虫全基因组DNA的微量提取，无需切割、挤破、研磨、冻融线虫，操作步骤更加简捷，最大程度地减少了DNA提取过程中样品污染和损失的环节，提取效率和成功率显著提高，有效地解决了以前植物寄生线虫DNA微量提取过程中存在的效率低、稳定性差、不易操作、步骤繁多等问题。利用本发明专利技术中的方法提取获得的线虫DNA满足植物寄生线虫DNA条码鉴定、RFLP酶切鉴定、特异引物PCR鉴定等分子检测技术的需求，可在我国口岸及农林部门检疫鉴定工作中推广应用。
【技术实现步骤摘要】
—种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液及其应用
本专利技术涉及植物寄生线虫检疫鉴定领域，提供了一种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液及其应用，具体而言，所述方法通过使用新的DNA提取裂解液，极大地简化了植物寄生线虫基因组DNA提取程序，显著提高了 DNA提取效率和成功率，有效地解决了以前植物寄生线虫DNA微量提取过程中存在的效率低、稳定性差、不易操作、步骤繁多等问题，适用于口岸及农林业相关检疫鉴定实验室应用。
技术介绍
传统的植物线虫鉴定方法主要依赖于形态特征和形态测量值，要求鉴定者要有极为丰富的经验和技巧。基于DNA的分子鉴定方法对鉴定者的要求相对较低，是形态鉴定的重要辅助手段，目前在线虫的分类鉴定中应用广泛。线虫分子鉴定的首要步骤是DNA的提取，通常来说包括线虫DNA大量提取和线虫DNA微量提取两种方法。而其中线虫DNA微量提取方法因其需要线虫量少、无需线虫纯化，同时具有简捷、廉价等优点，因而在线虫分子鉴定中备受青睐。关于线虫DNA微量提取方法有较多的研究报道。Barstead等(1991)和Williams等(1992)使用WLB裂解液成功提取了单条秀丽小杆线虫的DNA，也是目前能够追溯的最早建立的线虫DNA微量提取方法。Stanton等(1998)以根结线虫的二龄幼虫为材料，系统比较了微波加热法、水浴加热法、蛋白酶裂解法、直接磨碎法和NaOH法提取线虫DNA的效果，发现NaOH法提取成功 率可达81 %，直接磨碎法成功率为50%，其它方法效率较低。沈锡权等(2005)从单条固定海洋线虫中提取得到基因组DNA，并用于18S rRNA基因PCR扩增，发现蛋白酶K法获得的DNA比NaOH裂解法所获得的更适合PCR扩增。2011年，王江岭等提出使用液氮替代-80 0C冰箱冷冻线虫，进一步提高了单条线虫DNA提取的效率，可高效、稳定的提取滑刃类线虫的DNA，但提取短体线虫时效果较差。王金成等(2012)对王江岭等建立的方法进行了再次改进，解决了单条短体线虫DNA微量提取问题。虽然线虫DNA微量提取的方法很多，但大多数方法因操作复杂、步骤繁多或效率不高、稳定性不够等原因被淘汰，只有酶裂解法被广泛应用。但实践表明，酶裂解法的效率和稳定性仍然需要优化提高，操作步骤需要进一步简化，以适合更加多样的线虫DNA的提取。本研究以相对成熟的一种酶裂解法为基础，对其关键试剂一裂解液的组份和浓度进行了系统性的筛选和优化，以提出一种更加高效、稳定、廉价、简捷的线虫DNA微量提取方法，为植物寄生线虫的检疫鉴定提供部分技术支持。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有植物寄生线虫基因组DNA微量提取技术中存在的效率低、成功率低、步骤繁杂等缺陷，提供一种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液及其应用，所述裂解液如下:所述裂解液的配方包含:IOmM Tris-HCl (ρΗ8.3)，1.5mM MgCl2,60mM KCl，10mg/mL TritonX-100 (即曲拉通X-100)，0.2mM DTT (即二硫代苏糖醇)和 300 μ g/mL Proteinase K(即蛋白酶 K)。进一步地，本申请提供一种上述裂解液的制备方法，其特征在于:所述裂解液由10 XPCR Buffer (含 15mM 的 Mg2+)、IOOmM 的 KCl 溶液、IOOmg/mL的TritonX-100溶液、3000 μ g/mL的Proteinase K溶液、ImM的DTT溶液和双蒸水按1:1:1:1:2: 4的体积比混合配制而成。进一步地，本专利技术涉及一种将上述裂解液用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的应用，其特征在于:首先用双蒸水将线虫清洗干净，然后挑取单条线虫放入含5~20 μ L所述裂解液的PCR管中，最后56°C保温0.5~4h，95°C加热lOmin。经上述步骤提取获得的上清液即可用于分子实验。优选地，裂解液的使用量为10~15μ L，56°C保温的时间为I~3h。本申请的裂解液适用于多种植物线虫的基因组DNA微量提取，特别地，适用于穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、斯氏短体线虫(Pratylenchus scribneri) >松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(B.mucronatus)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)。 所述双蒸水即为经过两次蒸馏的无菌水，其通常用于分子生物学实验。所述裂解液配制所需试剂中的10XPCR Buffer (含15mM的Mg2+)和ProteinaseK(即蛋白酶K)均为TAKARA公司生产，产品货号分别为R001B和9033 ;所述裂解液中的KCl(即氯化钾)为天津市风船化学试剂科技有限公司生产，分析纯，批号为2013408 ;所述裂解液中的TritonX-100 (即曲拉通-100)和DTT (即二硫代苏糖醇)均为上海源叶生物科技有限公司生产，产品货号分别为12023和11175。与现有技术相比，本专利技术的进步在于:本专利技术的裂解液可直接用于植物寄生线虫全基因组DNA的微量提取，无需切割、挤破、研磨、冻融线虫，操作步骤更加简捷，最大程度地减少了 DNA提取过程中样品污染和损失的环节，提取效率和成功率显著提高，有效地解决了以前植物寄生线虫DNA微量提取过程中存在的效率低、稳定性差、不易操作、步骤繁多等问题。利用本专利技术的裂解液提取获得的线虫DNA满足植物寄生线虫DNA条码鉴定、RFLP酶切鉴定、特异引物PCR鉴定等分子检测技术的需求。【附图说明】图1使用裂解液I提取的线虫DNA样品用于核糖体ITS区PCR扩增检测结果；图2使用裂解液2提取的线虫DNA样品用于核糖体ITS区PCR扩增检测结果；图3使用裂解液3提取的线虫DNA样品用于核糖体ITS区PCR扩增检测结果；图4使用裂解液4提取的线虫DNA样品用于核糖体ITS区PCR扩增检测结果；图中各字母含义如下:泳道1-4:南京水稻干尖线虫；泳道5-8:拟松材线虫；泳道9-12:松材线虫；泳道13-16:穿刺短体线虫；泳道17-20:斯氏短体线虫。【具体实施方式】为能进一步了解本专利技术的
技术实现思路
、特点及功效，兹举以下实施例，并配合附图详细说明如下:标本来源本实验测试了 5个线虫群体，其中包括I个穿刺短体线虫群体,I个斯氏短体线虫群体，I个松材线虫群体，I个拟松材线虫群体，I个水稻干尖线虫群体。详情见下表:本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液，其特征在于，所述裂解液的配方包含：10mM Tris‑HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，60mM KCl，10mg/mL TritonX‑100，0.2mM DTT和300μg/mL Proteinase K。
【技术特征摘要】
1.一种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液，其特征在于，所述裂解液的配方包含:IOmM Tris-HCl (pH8.3)，1.5mM MgCl2, 60mM KCl, 10mg/mL TritonX-100,0.2mM DTT 和300 μ g/mL Proteinase K02.根据权利要求1所述的裂解液的制备方法，其特征在于: 所述裂解液由 10XPCR Buffer、IOOmM 的 KCl 溶液、100mg/mL 的 TritonX-1OO 溶液、3000 μ g/mL 的 Proteinase K 溶液、ImM 的 DTT 溶液和双蒸水按 1:1:1:1: 2: 4 的体积比混合配制而成，所述IOXPCRBuffer含15mM的Mg2+。3.根据权利要求1所述的裂解液...
【专利技术属性】
技术研发人员：王金成，顾建锋，林宇，张裕君，冯洁，陈先锋，黄国明，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：天津;12
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