基于枯草芽孢杆菌AR/BDH酶学性质高效发酵生产乙偶姻的策略，属于基因工程和发酵工程领域。通过研究本实验室自主筛选的具有独立知识产权的高产乙偶姻菌株B.subtilis JNA的AR/BDH酶学性质，首次发现该酶还原方向最适pH为6.5，氧化方向最适pH为8.5。基于该酶学特征，利用发酵策略使菌株在发酵前期处于最适生长pH条件(pH6.5)，发酵后期处于最佳转化pH条件(pH8.0)，可将150g/L葡萄糖转化为56.8g/L乙偶姻，2，3-丁二醇仅为6.1g/L，乙偶姻产率达到0.59g/(L·h)，提高了近84％；过量表达该酶的重组枯草芽孢杆菌在相同发酵策略调控下，消耗180g/L葡萄糖，乙偶姻产量提高至73.6g/L，产率最终达到0.77g/(L·h)，实现了加强目的菌株后期逆向转化生产乙偶姻的能力，为微生物工业化发酵生产乙偶姻提供了基础。
【技术实现步骤摘要】
基于枯草芽孢杆菌AR/BDH酶学性质高效发酵生产乙偶姻的策略
一种基于枯草芽孢杆菌AR/BDH酶学性质提高乙偶姻产量发酵策略，本专利技术属于基因工程和发酵工程领域。具体涉及一种乙偶姻还原酶/2，3- 丁二醇脱氢酶基因工程菌的构建及基于该酶酶学性质提高乙偶姻产量的发酵策略。技术背景乙偶姻在食品调香、生化及药理方面有着广泛的应用价值，目前国内外对其合成和生产都有着比较深入的研究。自然界中的某些细菌具有生产乙偶姻的能力，主要包括克雷伯氏菌属(Klebisella)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽抱杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)以及乳球菌属(Lactococcus)等。但是在大多数菌株代谢过程中，乙偶姻是作为2，3-丁二醇和丁二酮代谢的副产物而存在的，积累浓度较低，从而直接导致了难以利用这些微生物菌种工业化发酵生产乙偶姻。本实验室保藏有一株以葡萄糖为底物高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌B.subtilisJNA(保藏号CCTCC M209309 ;专利申请公布号CN101864381A)，研究发现其发酵过程中存在乙偶姻和2，3-丁二醇相互转化的现象，这一相互转化过程受到乙偶姻还原酶的调节。乙偶姻还原酶，又称2，3- 丁二醇脱氢酶(简称AR/BDH，E.C.1.1.1.4)。隶属于氧化还原酶，能够在NADH存在的情况下催化乙偶姻生成2，3-丁二醇，同时在NAD+存在的情况下催化2，3-丁二醇可逆形成乙偶姻。在枯草芽孢杆菌相关研究中，虽已确定了编码乙偶姻还原酶/2，3-丁二醇脱氢酶的基因，并命名为bdhA，但对其相关性质未能进一步研究。本专利技术通过表达载体pMA5,实现了 B.subtilis JNA乙偶姻还原酶(简称bdhA)的高效表达，首次对该酶进行了相关酶学性质研究。为枯草芽孢杆菌后期2，3-丁二醇逆向转化乙偶姻的机理研究提供了基础，并基于乙偶姻还原酶酶学性质，通过发酵策略调控，达到缩短发酵周期，加强后期逆向转化能力的目的，最终实现B.subtilis JNA高效生产乙偶姻。
技术实现思路
本专利技术所使用菌种为B.subtilis JNA，该菌株前期发酵葡萄糖合成2，3-丁二醇，后期逆向转化为乙偶姻，已保藏于中国典型培养物保臧中心，保藏地址:中国武汉，武汉大学；保臧编号为:CTCCM209309。本专利技术的主要研究内容:本专利技术利用分子技术克隆了来自B.subtilis JNA的乙偶姻还原酶基因(简称bdhA)，构建重组表达载体pMA5-bdhA，并将其转化至B.subtilisJNA，成功构建了基因工程菌株B.subtilis JNA/pMA5-bdhA。对构建的基因工程菌株进行酶活力测定及酶学性质研究发现:酶还原方向反应最适PH为6.5，酶氧化方向反应最适pH为8.5。基于这一酶学性质，通过发酵策略调控，发酵前期使菌株处于最适生长条件(PH6.5)，发酵后期通过加强逆向转化能力(ρΗ8.0)，最终B.subtilis JNA发酵96h，150g/L葡萄糖转化为乙偶姻约56.8g/L，副产物2，3- 丁二醇仅为6.lg/L,并且乙偶姻产率达到0.59g/(L*h)，与未经过发酵策略调控比较，产率提高了近84%。利用相同发酵策略，重组菌株B.subtilis JNA/pMA5-bdhA在前期控制pH6.5后期控制pH8.0条件下发酵96h，最终消耗180g/L葡萄糖，乙偶姻产量提高至约73.6g/L，产率最终达到0.77g/(L.h)。本专利技术的优点和积极效果是:(I)本专利技术首次探索了枯草芽孢杆菌来源的乙偶姻还原酶的酶学性质，为枯草芽孢杆菌后期2，3-丁二醇逆向转化乙偶姻的现象提供了一定的理论价值。(2)本专利技术基于乙偶姻还原酶的酶学性质，通过发酵策略调控，发酵前期使菌株处于最适生长条件(PH6.5)，发酵后期通过加强逆向转化能力(PH8.0)，实现高效生产乙偶姻的方法，最终B.subtilis 1應将15(^/1葡萄糖转化为乙偶姻约56.88/1，副产物2，3-丁二醇仅约为6.lg/L，并且乙偶姻产率达到0.59g/(L *h)，与未经过发酵策略调控比较，产率提高了近84% ;重组菌株B.subtilis JNA/pMA5-bdhA最终将180g/L葡萄糖转化为乙偶姻提高至约73.6g/L，产率最终达到0.77g/(L.h)。【附图说明】图1重组质粒pMA5-bdhA示意图。图2SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。图3pH对酶活力的影响。图4菌株B.subtilis JNA在5L-罐发酵曲线。图5 菌株 B.subtilis JNA/pMA5_bdhA 在 5L-罐发酵曲线。【具体实施方式】实施例1:目的基因的扩增及重组枯草芽孢杆菌的构建质粒pMA5_bdhA构建示意图如图1所示,具体过程如下:首先，以菌株B.subtilis JNA的染色体DNA为模板，利用引物Pl和P2，通过PCR技术扩增得到一段1041bp大小的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的bdhA基因，将纯化后的bdhA基因经限制性内切酶MluI和BamHI消化后，与同样经过上述两种限制性内切酶消化的质粒PMA5连接，构建重组质粒pMA5-bdhA，在T4DNA连接酶的作用下16°C过夜连接，将连接液转化至大肠杆菌感受态E.coli JM109中，挑取阳性转化子，提取转化子中的质粒，经酶切验证并确认重组质粒pMA5-bdhA构建成功。经双酶切验证后，表明该重组质粒构建成功。将重组质粒pMA5-bdhA以化学转化的方法转化至B.subtilis JNA,挑取阳性转化子，即得到重组枯草芽孢杆菌B.subtilis JNA/pMA5-bdhA。对原始菌以及重组菌胞内蛋白表达分析可以看出，基因bdhA在重组菌中成功实现过量表达。以B.subtilis JNA基因组总DNA为模板，设计两条引物，PCR扩增引物设计如下:Pl:5’ -ACCGGGATCCATGAAGGCAGCAAGATGG-3，(BamH I)P2:5， -ACCGACGCGTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTAGGTCTAACAAGG-3’ (Mlu I)实施例2:重组菌B.subtilis JNA/pMA5-bdhA乙偶姻还原酶活力测定(I)酶活测定缓冲体系乙偶姻还原酶:0.05M乙偶姻，50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，5mM NAD+ ； 2，3- 丁二醇脱氢酶:0.1M2，3_ 丁二醇，50mM 磷酸钠缓冲液 pH8.0, 5mM NADH ；(2)酶活测定将实施例1构建的重组菌B.subtilis JNA/pMA5_bdhA，与出发菌株B.subtilisJNA分别接种于IOmL含卡那霉素的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，次日按4%的接种量转接于LB培养基中，37°C培养24h，取发酵液于4°C，10000r/min离心10min，pH7.0的磷酸钠缓冲液清洗3次，悬浮在Z buffer中，超声波破碎处理制备粗酶液。将20 μ I粗酶液加入到酶活力测定缓冲体系中立即检测A34tl吸光值的变化。结果表明重组菌B.subtilis JNA/pMA5-bdhA表达的乙偶姻还原酶AR方向比酶活为89.85U/g，比出发菌株B.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种加强乙偶姻还原酶表达的重组枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，其特征在于：将SEQ IDNO：1所示的乙偶姻还原酶基因bdhA克隆到穿梭载体pMA5构建成为重组穿梭表达质粒pMA5‑bdhA并转化至保藏编号为CCTCC NO：M209309的枯草芽孢杆菌B.subtilis JNA中，从而对其酶学性质进行研究。
【技术特征摘要】
1.一种加强乙偶姻还原酶表达的重组枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，其特征在于:将SEQ IDNO:1所示的乙偶姻还原酶基因bdhA克隆到穿梭载体pMA5构建成为重组穿梭表达质粒pMA5-bdhA并转化至保藏编号为CCTCC NO:M209309的枯草芽孢杆菌B.subtilis JNA中，从而对其酶学性质进行研究。2.从权利要求1所述的重组菌株中获得乙偶姻还原酶/2，3-丁二醇脱氢酶，其特征为:该酶还原方向反应最适pH为6.5，酶氧化方向反应最适pH为8.5 ;该酶反应最适温度为50-55°C;Zn2+、Cu2+离子对酶还原方向活力有明显的抑制作用，Mg2+、Mn2+、Ca2+离子对酶氧化方向活力有明显的促进作用。3.根据权利要求2所述的乙偶姻还原酶/2，3_丁二醇脱氢酶的特征，应用于一种发酵策略提高乙偶姻产量的方法，其特征是...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，包腾，张显，赵晓静，杨套伟，徐美娟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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