产L-精氨酸的基因工程菌的构建方法及其用途技术

本发明专利技术涉及生产L-精氨酸的基因工程菌的构建方法和用途。本发明专利技术公开了一种新的生产L-精氨酸的基因工程菌菌株，为重组质粒pXMJ19-argH先后转化导入大肠杆菌和营养缺陷型黄色短杆菌AN78中，然后将含重组质粒的AN78中精氨酸琥珀酸酶过表达并且发酵生产L-精氨酸。本发明专利技术进一步公开了上述工程菌的构建方法及其用途。可以利用本发明专利技术构建的基因工程菌生产L-精氨酸，提高产量、降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及生产L-精氨酸的基因工程菌的构建方法和用途。本专利技术公开了一种新的生产L-精氨酸的基因工程菌菌株，为重组质粒pXMJ19-argH先后转化导入大肠杆菌和营养缺陷型黄色短杆菌AN78中，然后将含重组质粒的AN78中精氨酸琥珀酸酶过表达并且发酵生产L-精氨酸。本专利技术进一步公开了上述工程菌的构建方法及其用途。可以利用本专利技术构建的基因工程菌生产L-精氨酸，提高产量、降低生产成本。【专利说明】产L-精氨酸的基因工程菌的构建方法及其用途
本专利技术属于生物工程
，具体涉及生产L-精氨酸的基因工程菌，其构建方法及其用途。
技术介绍
L-精氨酸(L-argnine，简称L-Arg)是一种含有胍基的碱性氨基酸，是人体代谢的一种重要氨基酸，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢物，在医药、食品和饲料添加剂等行业具有广泛的用途，临床上，除作为复方氨基酸输液的主要组分之一外，L-精氨酸及其盐类还广泛用于治疗各类肝昏迷忌用谷氨酸钠者和病毒性肝类谷丙转氨酶异常者，对病毒性肝炎疗效显著。对肠道溃疡、血栓形成和神经衰弱等症都有治疗效果。另外，L-精氨酸是运动营养饮料配方的重要组成部分，也是一种重要的饲料添加剂，在世界养殖业中有广泛地应用。近年来，随着人民生活水平的逐步提高，人们对健康方面给于越来越多的关注，L-精氨酸的需求量也在逐年上升。目前全世界L-精氨酸年需求量达15000吨以上，实际年产量不到8000吨左右，主产地集中在日本和欧洲等国家和地区。我国目前实际年产量不到1200吨，产品主要出口到欧美等国家和地区，且其需求量每年以15%的速度递增。L-精氨酸工业化生产的技术工艺主要有两条:即蛋白质水解提取技术工艺；生物发酵技术工艺。国际上著名的大公司如日本味之素、协和发酵和德国迪高沙主要采用生物发酵和基因工程技术进行大规模生产L-精氨酸产品。由于L-精氨酸具有重要的应用价值，国内不少研究者正致力于L-精氨酸的开发研究，如高产菌的选育、工程菌的构建、发酵工艺条件的优化等。这些研究的成功将促进L-精氨酸水平的提高，有望彻底改变L-精氨酸依赖进口的被动局面，具有相当的经济效益和社会效益。L-精氨酸的整个代谢途径如图1.所示。由图可知，从中间代谢产物谷氨酸到终产物精氨酸的代谢途径是一个没有分枝的合成途径，L-精氨酸是合成途径的最终产物，此段合成途径有八步反应。根据精氨酸的生物合成途径及代谢调节机制可知:精氨酸是非支路代谢途径的终产物，并且精氨酸本身是其合成代谢的调节因子，所以精氨酸发酵不能用阻断代谢流或选育营养缺陷型菌种发酵方法。 随着基因工程技术的发展，它在精氨酸高产菌选育中的应用有很多成功的例子。利用DNA重组技术将精氨酸生物合成有关的酶基因片段插入质粒后再导入精氨酸产生菌，使目的基因拷贝数扩增，从而增加酶的合成量，提高精氨酸产量。1983年，滕亦等将精氨酸生物合成有关的基因进行克隆。然后将含精氨酸生物合成酶系基因群及卡那霉素抗性基因的重组质粒PEArgl导入到宿主谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，哈库利棒杆菌ATCC13868及黄色短杆菌ATCC 14067中，构建精氨酸工程菌，经72 h培养精氨酸产量分别为1.6 mg/ml、1.8 mg/ml>l.0 mg/ml。虽然利用基因工程构建L-精氨酸高产菌株是一种高效率、理性化的育种手段，但迄今为止，尚未有高产重组菌的报道。黄色短杆菌属于革兰式阳性菌，是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株。从精氨酸在黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌利用循环途径由谷氨酸合成精氨酸(图1)可以看出，精氨酸是由瓜氨酸透过胞质酵素精氨基琥珀酸合成酶(AS)及精氨基琥珀酸裂解酶(AL)合成。精氨酸琥拍酸酶(Argininosuccinate E.C.4.3.2.1) (AL)是合成途径中的最后一个酶，催化底物精氨酸琥珀酸合成精氨酸，如果我们将精氨酸琥珀酸酶基因过表达，从瓜氨酸到精氨酸的转化可能就会加速或提高。按照这一思路，我们首先克隆来自于谷氨酸棒杆菌的精氨酸琥珀酸酶(AL)的编码基因ar^H，与并在大肠杆菌BL21和黄色短杆菌AN78中高效表达。因此，构建了重组黄色短杆菌/ pXMJ19-argH，在黄色短杆菌AN78中加强AL的本底表达，并对重组黄色短杆菌杆菌进行酶活和发酵产精氨酸初步分析。
技术实现思路
本专利技术的技术方案如下: 总体技术方案是克隆包括谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等谷氨酸棒杆菌精氨酸琥珀酸酶的基因，利用合适的载体和限制性内切酶片段，构建重组表达载体，将精氨酸琥珀酸酶基因克隆到合适的宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌、酵母、CHO细胞、昆虫细胞等。1.基因模板提取:将待精氨酸琥珀酸酶基因的菌株在肉汁培养基等谷氨酸棒杆菌能够生长的培养基中，培养到合适的菌体浓度，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂盒方法提取菌体DNA，作为基因扩增的模板。2.精氨酸琥珀酸酶基因的克隆:根据出发菌株的碱基特征和精氨酸琥珀酸酶基因的保守序列，设计引物，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂个方法，通过PCR扩增精氨酸琥珀酸酶基因。 3.转化载体的构建、转化和转化子筛选:按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、完全可与从商业途径获得的载体、限制性内切酶和方法，将目标基因克隆到载体，转化宿主细胞，筛选转化子。4.重组菌的摇瓶发酵:按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、方法，按照文献进行摇瓶发酵，紫外分光光度法检测L-精氨酸的含量.专利技术效果 利用本技术方案涉及的方法，构建了基于精氨酸琥珀酸酶与PXMJ19的重组质粒，再将重组质粒转化进入大肠杆菌BL21和筛选的高产突变株AN78中，诱导表达重组酶，以及摇瓶发酵的产L-精氨酸，以期实现高产菌株-黄色短杆菌AN78的重组菌中L-精氨酸产量的提闻。【专利附图】【附图说明】图1精氨酸生物合成途径。图2精氨酸琥珀酸酶的系统进化。利用已有的精氨酸琥珀酸酶序列和软件clustalxl.83 的 treeTop 程序(www.genebee.msu.su/genebee.html)进行比对(分支距离(X轴)代表利用BL0SUM62)取代矩阵获得的亲缘关系。图3 PCR产物1.2%琼脂糖凝胶电泳分析:1，2泳道是以AN78基因组为模板PCR产物；3泳道是以13032基因组为模板的PCR产物；4泳道是Marker，从上到下2000 bp, 1000bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp ;5，6 泳道是阴性对照。图4重组质粒pXMJ19_argH双酶切检测:1泳道是Marker，从上到下分别为，10000bp, 7000 bp, 4000 bp, 2000 bp, 1000 bp, 500 bp, 250 bp;2 泳道为 I 单酶切的质粒pXMJ19-argH ；3 )織％ BamH I单酶切的质粒pXMJ19_argH ；4泳道为抽提的质粒，5泳道为EcoR I热BamH I双酶切重组质粒pXMJ19_argH。图5 SDS-PAGE分析诱导表达精氨酸琥珀酸酶:1泳道是BL21诱导破碎后上清分析蛋白；2泳道是未诱导BL21破碎后上清分析蛋白；3泳道是低蛋白Marker，从上到下是97.2kD，66.4 kD，44.3 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产L‑精氨酸的基因工程菌株，其特征在于，该菌株为用重组基因工程质粒pXMJ19‑argH转化的营养缺陷型黄色短杆菌AN78(p‑argH)。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王翠平，马承国，王开成，张传军，
申请(专利权)人：上海凯圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31