本发明专利技术公开了一株经过改良细胞壁组成而提高了对发酵环境的多种耐受性的Saccharomyces carlsbergensis，已于2012年01月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCC No.7114。该菌株具有改良的细胞壁结构并获得高浓度乙醇，高温，高渗透压耐受性，在高浓发酵中表现更高的发酵效率，发酵所得啤酒也更加洁白细腻。此菌株经传统紫外诱变筛选获得，在啤酒行业中具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一株对啤酒发酵环境具有多种耐受性的啤酒酵母及其应用
本专利技术涉及一株经过改良细胞壁组成而提高了对发酵环境的多种耐受性的啤酒酵母，属微生物领域。
技术介绍
啤酒酵母在发酵过程中由于工艺操作和环境条件的变化，经受着各种发酵环境因素的影响。从起始接种至充气麦汁至最终发酵结束时收获酵母泥，酵母细胞必须应对原麦汁的高渗环境，乙醇的逐渐积累，营养物质逐渐匮乏等压力。啤酒酵母对这些压力的耐受性直接影响发酵周期及成品啤酒的质量，进而影响着最终的经济效益。采用高浓度发酵和后稀释技术是提高企业发酵设备的产能和利用率的做有效手段，但在高浓度麦汁发酵过程中，酵母对发酵环境的耐受性显得尤为重要。所以提高啤酒酵母发酵环境的多种耐受性对啤酒行业的发展意义重大。在 国内啤酒行业，有关酵母对发酵环境因素的耐受性的研究尚处于起步阶段，而在国外已经获得一定的重视。酵母应对发酵环境因素的影响是一个系统的反应，称为一般压力应对机制(GSR)。GSR被认为是酵母的适应环境的进化结果，通常会引起约200个基因的上调及相应的蛋白质的表达量增加。国外一些研究者通过基因操作使得这些基因中的一部分在正常情况下过量表达，从而获得了压力耐受菌株并取得一定效果。然而工程菌株在食品行业存在争议性，使得这种方法的应用受到一定的限制。通过驯化获得耐性菌株则有着周期长，抗性种类单一的劣势。根据前人对酵母应对发酵环境压力的影响研究发现，酵母细胞壁在压力应对过程中也发挥着重要的作用。啤酒酵母细胞壁是由甘露聚糖蛋白、β-1，6_葡聚糖、β-1，3-葡聚糖和几丁质等相互交链构成的复杂的双层网状结构。内层的β-1，3-葡聚糖和几丁质负责保持细胞壁的刚性，外层甘露糖蛋白通过β_1，6-葡聚糖连接到内层则决定了细胞壁的透过性。这些组分协同起来保护细胞，使细胞在压力条件下能继续保持活力进而高效的发酵麦汁。研究发现在应对压力时，细胞壁会发生结构上的变化:细胞壁变厚，甘露糖蛋白含量增加。这些变化使得细胞壁结构变强壮，更有利于细胞的生存。关于酵母细胞壁的研究发现β-1，3-葡聚糖合成酶抑制剂抗性菌株的细胞壁组成会发生类似的变化。本方法采用传统紫外诱变手段，以酵母细胞壁葡聚糖合成酶抑制剂-米卡芬净抗性为筛选条件，再在此基础上进一步筛选获得耐高渗透压，高浓度乙醇，高温的优良啤酒酵母菌株。此方法相对简单方便且有利于在生产中应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一株对发酵环境具有多种耐受性的啤酒酵母菌MR1_2(Saccharomyces carlsbergensis),已于2013年01月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCCN0.7114，保藏地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。所述酵母MR1-2细胞壁多糖组分甘露聚糖、β_葡聚糖和几丁质含量相比出发菌株分别增加了 32.6%、51.9%和30.7%。所述酵母MR1-2的菌落形态，呈卵圆形，直径约6.5μπι ;ΥΕΗ)固体培养基上培养3d后长出约2mm直径的圆形菌落；菌落呈乳白色，表面湿润、粘稠，易被挑起。所述酵母MR1-2的获得方法是，将出发菌株在30W紫外灯距离30cm处照射20s，涂布35ng/ml米卡芬净平板,挑取在35ng/ml米卡芬净平板上长势较好的菌落,在10%乙醇(v/v),35°C,lM NaCl等压力条件下筛选，筛选在所有压力条件下表现出生长优势的菌株啤酒酵母MR1-2。所述多耐性啤酒酵母MR1-2应用于高浓发酵表现出更高的发酵效率，啤酒泡沫更加洁白细腻。【附图说明】图1，啤酒酵母Y-1对米卡芬净的敏感性柱形图；图2，耐性菌株MR1-2与原菌Y-1在不同压力条件下的生长情况；图3，耐性菌株MR1-2与原菌Y_1细胞壁主要多糖含量；图4，耐性菌株MR1-2与原菌Y_1细胞壁几丁质含量；图5，耐性菌株MR1-2与原菌Y_1高浓度麦汁发酵曲线。 【具体实施方式】菌种:I)出发菌株:啤酒酵母Y-1，已于1993年9月8日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC N0.M93049Y-12)培养基:YPD基本培养基:酵母提取粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，固体培养基添加2%琼脂粉。乙醇培养基:在基本培养基基础上添加8%或10% (v/v)乙醇。NaCl培养基:在基本培养基基础上添加1.0M/L NaCl。营养饥饿培养基:同基本培养基，细胞经饥饿处理后在YPD固体培养基上进行梯度生长。实施例1对发酵环境具有多种耐受性啤酒酵母的获得将出发菌在含不同浓度米卡芬净的YEH)固体培养基上培养，如图1所示，当米卡芬净浓度达到35ng/mL时，出发菌株不能生长,故选取35ng/mL作为筛选米卡芬净抗性菌株的条件。以江南大学生物工程学院保藏的一株啤酒酵母为出发菌株，在30W紫外灯距离30cm处照射20s后涂布35ng/ml米卡芬净平板。挑选能在10%乙醇(v/v)、35°C、IM NaCl压力条件下具有生长优势的酵母菌株。如图2所示，MR1-2在所有压力条件下表现出生长优势。所得酵母呈卵圆形，直径约6.5μπι ;YEH)固体培养基上培养3d后长出约2mm直径的圆形菌落；菌落呈乳白色，表面湿润、粘稠，易被挑起。实施例2酵母细胞壁多糖组分分析将培养至稳定期的酵母细胞离心收集，取约IOOmg湿酵母细胞用去离子水洗涤3遍。将细胞重新悬浮于0.5mL10mM Tris-HCl (pH8.0)缓冲液并转移至5mL具塞玻璃试管。添加0.5g的直径400 μ m的干燥洁净的玻璃珠，然后在漩涡混合仪上振荡5个循环，每个循环振荡3min、冰浴3min。处理后的酵母细胞用去离子水洗涤3遍，收集沉淀即为酵母细胞壁，45°C真空干燥过夜即得干燥细胞壁。称取约IOmg干燥细胞壁加入150 μ L72%(w/w)硫酸在室温下放置3h(间隔适当振动促进酸解)。之后加入0.95mL纯水稀释并真空封管，封管后沸水浴4h即得多糖水解液。水解液用氢氧化钡中和至中性，再经过适当稀释过滤后，用高效离子色谱检测单糖含量，进一步计算得出细胞壁中应的多糖含量。如图3、图4所示，相比于出发菌株，啤酒酵母MR1-2细胞壁甘露聚糖、葡聚糖和几丁质含量分别增加了 32.6%、51.9%和30.7%。实施例3对发酵环境具有多种耐受性的啤酒酵母的高浓发酵性能测试将经扩培得到的酵母泥按0.5% (w/v)的比例接种于含有300mL18oP的新鲜定型麦汁的3L三角瓶中，于上发酵栓15°C发酵，每天测量发酵装置重量计算CO2失重，每隔2d采用比重瓶法测定发酵清液的浓度。如图5所示，相比于出发菌株，啤酒酵母MR1-2表现出更高的发酵效率，所得啤 酒泡沫更洁白细腻。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株对啤酒发酵环境具有多种耐受性的Saccharomyces carlsbergensis，于2012年01月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7114，保藏地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；能够耐受35ng/mL米卡芬净、10%的乙醇、35℃、1M NaCl和无菌水中饥饿培养24h。
【技术特征摘要】
1.一株对啤酒发酵环境具有多种耐受:性的Saccharomyces carlsbergensis,于2012年01月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.7114，保藏地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；能够耐受35ng/mL米卡芬净、10%的乙醇、35°C、1M NaCl和无菌水中饥饿培养24h。2.根据权利要求1所述的Saccharomycescarlsbergensis,相比于出发菌株细胞壁组分中甘露聚糖、β -葡聚糖和几丁质的含量分别增加了 32.6%、51.9%和30.7%。...
【专利技术属性】
技术研发人员：李崎，王金晶，李欣儿，李永仙，刘春凤，朱林江，郑飞云，顾国贤，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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