本发明专利技术公开了一株凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）H-1及利用该菌进行原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法。本发明专利技术的菌株为凝结芽孢杆菌H-1，保藏号为CCTCC NO：M2013105。通过种子液培养，然后于50～60℃发酵50～250小时，得到高光学纯度的乳酸钙。使用原位产物分离发酵技术连续发酵，发酵罐中的产量终浓度为167～171g/L，同时可获得结晶出的乳酸钙晶体，生产速率可达5g/L/h，光学纯度可达99.7%，转化率可达0.95g/g。半连续的发酵过程可根据需要多次结合原位产物分离技术，分离过程简便、经济、高效、环保，并且可持续。利用本发明专利技术的方法发酵生产乳酸钙，能够在节约成本的同时提高生产效率，具有重要的工业应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一株凝结芽孢杆菌及其在原位产物分离发酵生产乳酸钙中的应用
本专利技术属于生物发酵工程
中乳酸钙的生产方法，尤其是涉及一株凝结芽孢杆菌、及利用该菌进行开放式原位产物分离发酵连续生产光学纯乳酸钙的方法。
技术介绍
乳酸(Lactic Acid)，又名α —羟基丙酸，根据旋光性不同可分为L 一乳酸(左旋性)、D —乳酸(右旋性)和消旋乳酸。乳酸是一种多用途的有机酸，可广泛应用于食品、医药、化工、印染等领域。其中，最重要、最广泛的工业应用是作为聚乳酸合成的单体。聚乳酸具有良好的生物可降解性和生物相容性，不仅在当今石油资源日益短缺的情况下很有希望成为石油基塑料的替代品，也被产业界认为一种最有发展前途的新型医学材料。因此光学纯L一乳酸的生产有着重要的意义。乳酸钙是一种重要的食品添加剂，广泛应用于乳制品、保健品、饮料等领域。乳酸钙可用作营养强化剂来补充钙元素，相对其他钙类更容易被人体吸收，对预防佝偻病、缺钙症、手足抽搐症等有重要意义。乳酸钙可作为膨松剂和缓冲剂应用于面包、糕点、奶粉和腌制品等的制作。此外，乳酸钙是一种安全有效的固化剂，可应用于新鲜切割的蔬菜和肉类的保鲜方面。乳酸钙可由生产出的乳酸进行酸碱反应来制备，也可由使用氢氧化钙或者碳酸钙调节PH的乳酸发酵过程直接获得。乳酸的生产方法主要有微生物发酵法、化学合成法和酶催化法。作为大规模生产中最主要的生产方法，微生物发酵法可以用纤维素、淀粉等可再生资源的水解液作为原料生产乳酸，通过使用不同的菌株可获得光学纯的L 一乳酸、D 一乳酸或是两者的混合物，其生产成本低，产品安全性高，并且环境污染小。凝结芽孢杆菌是一种耐热的可发酵生产光学纯L 一乳酸的微生物，可以实现在较高温度(45~60°C)条件下的开放式发酵，很大程度上降低发酵过程中污染杂菌的可能性，保证了终产物的高光学纯度。此外，凝结芽孢杆菌的营养要求低，可以非常经济的进行大规模的发酵生产。目前大规模的乳酸发酵基本采用分批发酵模式，这种发酵模式技术要求低、操作简便、产物终浓度高，但在生产过程中发酵罐的利用率偏低:分批发酵在每次发酵开始前的培养基配制、升温等准备工作需要占用一定的时间；发酵结束时，发酵液的处理、排放、罐体的清洗等也会占用较长时间，这都极大降低了发酵罐的利用率，从而提高了生产成本。此外，为了配合分批发酵需要不断的进行种子液的制备，制种过程的原料和能源消耗也会提高生产成本。半连续发酵方法和全细胞回收的重复发酵方法可以极大的提高发酵罐的利用率，通过直接利用前一批次中的大量菌体可以持续的进行多个批次的发酵，无需重复进行种子的制作。持续的获得高浓度的发酵终产物可以让整个生产过程更经济，尤其是对耗能较高的产物浓缩步骤。在普通的分批发酵方式中，终产物只能在发酵结束时一次性获得，这很可能会对后处理过程带来因发酵过程本身所需的时间上的延误。原位产物分离发酵是一种将后处理过程中的产物分离技术应用在发酵过程中的发酵模式，可在发酵进行的同时不断的分离出终产物。常见的原位产物分离发酵一般采取电渗析、离子交换、有机溶剂萃取等产物分离技术，这些分离技术有的对设备要求高，有的对发酵所用的微生物有细胞毒性，还有的会造成大量的底物损失，在工业生产的应用中存在一定的局限性。因此，本领域技术人员致力于开发一种原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，以简化操作、缩短生产时间、降低生产成本。
技术实现思路
有鉴于现有技术中常见的电渗析、离子交换、有机溶剂萃取等产物分离技术，对设备要求高、对发酵所用的微生物有细胞毒性、或会造成大量的底物损失、在工业生产的应用中存在一定的局限性等缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种开放式原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，以葡萄糖作为发酵培养基的碳源，通过在开放式半连续发酵模式的基础上结合了以乳酸钙结晶为原理的原位产物分离技术来持续高效的进行乳酸钙的生产，最终获得高光学纯乳酸钙，在节约成本的同时明显的提高了生产效率，适合于工业生产中推广应用。本专利技术通过以下技术方案解决解决上述技术问题:提供一株凝结芽孢杆菌,该凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)H-1，于2013年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2013105o通过16S rRNA分析，可知该菌株为凝结芽孢杆菌，具体的16S rRNA序列如序列表。进一步地，凝结芽孢杆菌H-1在制备乳酸钙中的应用，即在半连续发酵过程中结合原位产物分离技术，发酵连续生产乳酸钙。本专利技术还提供一种原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，其特征在于，包括如下步骤:(I)斜面培养:将凝结芽孢杆菌H-1接种于斜面培养基上，50~60°C条件下，培养24~48小时；优选地，将凝结芽孢杆菌H-1接种于含有15g/L琼脂的固体斜面培养基上，50~60°C条件下，培养18~36小时；(2)种子培养:将斜面培养物接种到种子培养基中，加入碳酸钙控制发酵液pH，50~60°C条件下，静止培养10~24小时，制备种子培养液；转接入发酵罐中，45~60°C，60~150rpm，培养10~20小时，制得发酵罐种子培养液；优选地，种子培养是指:将经过斜面培养的凝结芽孢杆菌在无菌条件下接种到20~40mL种子培养基中，50~60°C条件下，加入中和剂维持pH为5.5~6.5条件下，静止培养15~24小时；以10% (v/v)接种量同样条件扩增到200~400mL后全部转入含2~3L种子培养基的5升发酵罐中，50~60°C，60~lOOrpm，加入中和剂维持发酵液pH为5.5~6.5，在此条件下培养10~20小时，制得发酵罐种子培养液；(3)发酵培养:将发酵罐种子培养液接入发酵培养基中，在40°C~60°C环境下，控制pH为5.5~6.5，半连续发酵培养50~250小时；(4)产物分离:在步骤(3)所述的发酵培养中，多次进行以乳酸钙为晶种的原位产物分离，直至生产速率明显下降。优选地，步骤(3)的发酵培养采用发酵培养基，按15~25% (v/v)的接种量接入发酵罐种子培养液中。其中，温度优选50°C~55°C，接种量优选20~25% (v/v)。进一步地，步骤(4)的以乳酸钙为晶种的原位产物分离方法是指:将糖含量低于10g/L的发酵液流入结晶槽中，降温到15~35°C后，添加2~8% (w/v)的晶种，结晶2~5小时。进一步地，步骤(3)的半连续发酵工艺是指:当发酵液中葡萄糖剩余O~10g/L时取出40~60% (v/v)的发酵液在结晶槽中进行乳酸钙分离，然后补加20~30% (v/v)的葡萄糖含量为500g/L的发酵培养基继续发酵，2~5小时后将结晶槽中的上清液回流到发酵罐中，原位产物分离步骤结束后向发酵罐中补充50g/L的葡萄糖，继续发酵直至发酵罐中的葡萄糖耗尽。进一步地，晶种为五水乳酸钙晶体。进一步地，在步骤(3)半连续发酵培养中包含补料流加工艺，该补料流加工艺是指:当发酵液中葡萄糖含量低于10g/L时，首先流出部分发酵液到所述结晶槽中用于所述原位产物分离，然后补加葡萄糖含量为400~600g/L的发酵培养基维持发酵，当所述原位产物分离步骤结束后再将所述结晶槽中的上清液流回发酵罐中，使发酵罐中的总葡萄糖含量维本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）H‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013105。
【技术特征摘要】
1.一株凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)H-l，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013105。2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌H-1在制备乳酸钙中的应用，其特征在于，在半连续发酵过程中结合原位产物分离技术，发酵连续生产乳酸钙。3.—种原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)斜面培养:将凝结芽孢杆菌H-1接种于斜面培养基上，50~60°C条件下，培养24~48小时； (2)种子培养:将斜面培养物接种到种子培养基中，加入碳酸钙控制发酵液pH，50~60°C条件下，静止培养10~24小时，制备种子培养液；转接入发酵罐中，45~60°C，60~150rpm，培养10~20小时，制得发酵罐种子培养液； (3)发酵培养:将发酵罐种子培养液接入发酵培养基中，在40°C~60°C环境下，控制pH为5.5~6.5，半连续发酵培养50~250小时； (4)产物分离:在步骤(3)所述的发酵培养中，多次进行以乳酸钙为晶种的原位产物分离，直至生产速率明显下降。4.根据权利要求3所述的原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，其特征在于，所述步骤(4)的以乳酸钙为晶种的原位产物分离方法是指:将糖含量低于10g/L的发酵液流入结晶槽中，降温到15~35°C后，添加2~8% (w/v)的晶种，结晶2~5小时。5.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：许平，徐轲，倪俊，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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