一种核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种式（1）所示的核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法。本发明专利技术采用保护的核苷酸和/或寡核苷酸盐作为原料，合成反应在反应瓶或反应釜中进行，不受固相载体或合成仪的限制，可实现大规模制备核苷酸和/或寡核苷酸。式（1）

【技术实现步骤摘要】
一种核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法
本专利技术涉及化学生物学领域，具体地，涉及一种核苷酸和/或寡核苷酸，以及该核苷酸和/或寡核苷酸的制备方法。
技术介绍
化学合成寡核苷酸是指通过促使核苷酸单体间形成5’-3’磷酸二酯键，从而将多个核苷酸单元连接为寡核苷酸链的过程，其中涉及保护的核苷酸的合成。合成寡核酸的方法有固相合成法和液相合成法，固相合成法通常使用亚磷酰胺缩合反应方式，液相合成法通常使用磷酸三酯缩合反应方式或者氢膦酸酯缩合反应方式。相比于固相合成法，液相合成具有中间体易鉴定，反应规模易方达的特点。因此，液相合成法更适用于规模制备寡核酸，这在合成生产医药用途的寡核酸上具有重要意义。氢膦酸法合成寡核酸是一种高效的缩合方式，但是在应用液相氢膦酸法合成RNA的时候，缺少一种好的保护基用于保护核苷3’端，在文献中所报道的例如用乙酰丙酰基保护核苷3’端的方法只适用于合成DNA，当应用于合成RNA时，乙酰丙酰基的脱除条件会导致核糖核苷2’位保护基（如TBDMS）发生2’→3’的迁移反应，导致产率降低和产生副产物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种液相氢膦酸法合成RNA的方法，克服了目前的固相寡核苷酸合成方法的合成规模小、成本高等缺点，提供一种能够大规模合成寡核苷酸的方法。本专利技术中设计了一种硼烷基掩蔽的氢膦酸三酯核苷酸，可以应用于液相氢膦酸法合成RNA中，这种硼烷基氢膦酸三酯核苷可经过脱保护直接得到氢膦酸单酯核苷，并应于缩合反应中，不会引起2’位保护基发生2’→3’的迁移反应。本专利技术可应用于液相法规模制备RNA。本专利技术提供了一种式（1）所示的核苷酸和/或寡核苷酸：式（1）其中，R为氢或R1，R1表示三苯甲基或单甲氧基三苯甲基；R2和R7各自独立地为具有位阻型硅烷结构的基团；m为0-100的整数，n为0或1；R3和R8各自独立地为环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的R3相同或不同；R4为或-S-CH2CH2CN；R4’为氢或R4；R5和R6各自独立地为-CH2CH2CN或R9为-CH3、卤素原子、-NO2或-OCH3。本专利技术提供的式（1）的物质中，当R为H时，式（1）与如下所述的x大于等于1时的式（2）等价；当R为R1时，式（1）与如下所述的式（4）等价。本专利技术还提供了一种液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，其特征在于，该方法包括：在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式（2）的物质与式（3）的物质在第一液态反应介质中接触进行缩合反应，得到式（4）的物质；式（2）式（3）式（4）其中，x为0-50的整数；y为0-50的整数；式（2）、式（3）和式（4）中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8的定义与式（1）中相同；A+表示三烷基铵离子或二烷基铵离子。本专利技术还提供了一种核苷酸和/或寡核苷酸的制备方法，该方法包括：在第六液态反应介质中，将式（7）所示的物质与BH3接触，得到式（8）所示的物质；式（7）式（8）式（7）和式（8）中，n、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8的定义与式（1）中的定义相同。本专利技术提供的方法得到的脱去保护基的寡核苷酸，可以具有生物活性，可以用于各种寡核苷酸的用途，例如RNA干扰。本专利技术由于在液相中进行反应，不需要使用固相载体，又由于底物不需数倍过量，节省了原料，降低了成本。本专利技术采用保护的核苷酸和/或寡核苷酸盐作为原料，合成反应在反应瓶或反应釜中进行，不受固相载体或合成仪的限制，可实现大规模制备核苷酸和/或寡核苷酸。具体实施方式本专利技术提供了一种式（1）所示的核苷酸和/或寡核苷酸：式（1）其中，R为氢或R1，R1表示三苯甲基或单甲氧基三苯甲基；R2和R7各自独立地为具有位阻型硅烷结构的基团；m为0-100的整数，n为0或1；R3和R8各自独立地为环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的R3相同或不同；R4为或-S-CH2CH2CN；R4’为氢或R4；R5和R6各自独立地为-CH2CH2CN或R9为-CH3、卤素原子、-NO2或-OCH3。且各个重复单元中的R9可以相同或不同，其中R9在苯环上的位置没有限制，可以为邻位、间位或对位。其中n=1时，上述式（1）表示的是核苷酸，n为大于1的整数时，上述式（1）表示的是寡核苷酸。在式（1）中，所述的位阻型硅烷结构的基团可以为各种具有位阻和保护功能的硅烷基团，优选为叔丁基二甲基氯硅烷基、苯基二甲基氯硅烷基、叔丁基二苯基氯硅烷基或三异丙基氯硅烷基，更优选为叔丁基二甲基氯硅烷基，且各个重复单元中的R2可以相同或不同。在式（1）中，作为保护基的各个所述酰基可以相同或不同，各自可以为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基。在式（1）中，所述的卤素原子可以为氟、氯、溴或碘，优选为氯或溴，更优选为氯。本专利技术提供的式（1）的物质中，当R为H时，式（1）与如下所述的x大于等于1时的式（2）等价；当R为R1时，式（1）与如下所述的式（4）等价。本专利技术还提供了一种液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，其特征在于，该方法包括：在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式（2）的物质与式（3）的物质在第一液态反应介质中接触进行缩合反应，得到式（4）的物质；式（2）式（3）式（4）其中，x理论上可以为任意非负整数，优选为0-50的整数，更优选为0-25的整数，更进一步优选为0-15的整数；y理论上可以为任意正整数，优选为1-50的整数，更优选为1-25的整数，更进一步优选为1-15的整数；式（2）、式（3）和式（4）中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、和R8的定义如式（1）中所述；A+表示三烷基铵离子或二烷基铵离子；所述的三烷基铵离子或二烷基铵离子中的各个烷基可以相同或不同，可以各自具有1-6个碳原子，优选具有1-4个碳原子。其中，所述缩合反应所使用的缩合剂以及缩合反应的条件可以是本领域普通技术人员所熟知的，本专利技术对其没有特别的限制，例如，可以使用1-均三甲苯磺酰三唑、1-均三甲苯磺酰(3-硝基)-三唑、1-均三甲苯磺酰四唑、1-均三异丙基苯磺酰三唑、1-均三异丙基甲苯磺酰(3-硝基)-三唑和1-均三异丙基磺酰四唑中的一种或多种作为缩合剂。其中，所述第一液态反应介质的选择可以是本领域普通技术人员所熟知的，只要能溶解参与反应的物料即可，本专利技术对其没有特别的限制，例如，可以使用吡啶、二氯甲烷、乙腈、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种作为所述第一液态反应介质。其中，所述缩合反应条件可以包括：相对于1摩尔的式（3）的物质，式（2）的物质的用量可以为0.3-1.25摩尔。其中，相对于1摩尔的式（3）的物质，缩合剂的用量可以为2-20摩尔，优选可以为2-5摩尔。其中，相对于1摩尔的式（3）的物质，第一液态反应介质的用量可以为2-50升，优选可以为2-30升。其中，上述缩合反应温度可以为0-50℃，优选可以为20-40℃；反应时间可以为0.5-100小时，优选可以为1-10小时。根据本专利技术的一种优选实施方式，其中，该方法还可以包括如下步骤：在第二液态反应介质中，将式（4）的物质与式（5）的物质接触，得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核苷酸和/或寡核苷酸，所述核苷酸和/或寡核苷酸如式（1）所示：式（1）其中，R为氢或R1，R1表示三苯甲基或单甲氧基三苯甲基；R2和R7各自独立地为具有位阻型硅烷结构的基团；m为0‑100的整数，n为0或1；R3和R8各自独立地为环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的R3相同或不同；R4为或‑S‑CH2CH2CN；R4’为氢或R4；R5和R6各自独立地为‑CH2CH2CN或R9为‑CH3、卤素原子、‑NO2或‑OCH3。

【技术特征摘要】
1.一种核苷酸和/或寡核苷酸，所述核苷酸和/或寡核苷酸如式(1)所示：其中，R为氢或R1，R1表示三苯甲基或单甲氧基三苯甲基；R2和R7各自独立地为具有位阻型硅烷结构的基团；m为0-100的整数，n为0或1；R3和R8各自独立地为环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的R3相同或不同；R4为-S-CH2CH2CN；R4’为氢或R4；R5和R6各自独立地为-CH2CH2CN或R9为-CH3、卤素原子、-NO2或-OCH3；其中，具有位阻型硅烷结构的基团为叔丁基二甲基硅基、苯基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基或三异丙基硅基；所述酰基为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基；所述卤素原子为氯或溴。2.一种液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，其特征在于，该方法包括：在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式(2)的物质与式(3)的物质在第一液态反应介质中接触进行缩合反应，得到式(4)的物质；其中，式(2)、式(3)和式(4)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8的定义与权利要求1中的相同；x为0-50的整数；y为0-50的整数；A+表示三烷基铵离子或二烷基铵离子。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述缩合反应的条件包括：相对于1摩尔的式(3)的物质，缩合剂的用量为1-30摩尔，第一液态反应介质的用量为5-50L，式(2)的物质的用量为0.3-1.25摩尔；反应温度为-50℃至50℃；反应时间为0.2-10小时。4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述酰基为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基；所述的三烷基铵离子或二烷基铵离子中的各个烷基相同或不同，并且各自具有1-6个碳原子；所述缩合剂为氯磷酸二苯酯、双(2-氯苯基)磷酰氯和叔丁基乙酰氯中的一种或多种；所述第一液态反应介质为吡啶或吡啶与二氯甲烷、乙腈、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种的混合溶液。5.根据权利要求2-4中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括如下步骤：在第二液态反应介质中，将式(4)的物质与式(5)的物质接触，得到式(6)的物质；其中，式(5)和式(6)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8的定义与权利要求1中的相同。6.根据权利要求5所述的方法，其中，相对于1摩尔的式(4)的物质，第二液态反应介质的用量为5-50L，式(5)的物质的用量为1-10摩尔；反应温度为零下50℃至50℃；反应时间为0.2-10小时。7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二液态反应介质为吡啶或吡啶与二氯甲烷、乙腈、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种的混合溶液。8.根据权利要求5所述的方法，其中，该方法还包括如下步骤：(1)在第三液态反应介质中，将式(6)的物质与烷基胺接触，以脱去R5；(2)在第四液态反应介质中，将脱去了R5的式(6)的物质与氯代乙酸和甲氧基三苯甲醇接触，以脱去BH3基团；(3)在第三液态反应介质中，将脱去了R5和BH3基团的式(6)的物质与烷基胺接触，以脱去R6；其中，所述烷基胺中的各个烷基相同或不同，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：席真，黄金宇，陆威，
申请(专利权)人：昆山市工业技术研究院小核酸生物技术研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32