单细胞全基因组扩增方法技术

提供了用于扩增单细胞全基因组的方法和成分。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】提供了用于扩增单细胞全基因组的方法和成分。【专利说明】相关申请号该申请请求对下列美国临时专利的优先权:#61/621，271，2012-4-6提交；#61/550, 667，2011-10-24 提交；#61/510, 539，2011-7-22 提交；#61/490, 790，2011-5-27 提交；政府利益声明该专利技术获NIH3R01HG005097-02和3R01HG005097-02S1经费支持。政府对该专利技术有一定权利。
本专利技术的实施方式通常涉及用于扩增基因组序列如单细胞全基因组扩增的方法与成分。
技术介绍
目前使用随机引物扩增DNA与RNA的一个常见问题是引物二聚体的形成。引物使用浓度需要足够高以取得有效扩增，高浓度引物导致二聚体的形成，明显降低引物与DNA或RNA模板的结合。使用随机引物扩增DNA的其它问题包括由于位点丢失而无法扩增基因组的全部，短小扩增物的生成，以及有时无法扩增部分降解或有人工修饰的DNA。文献中已经有关于基因组PCR扩增方法的报道，例如US7，718，403，US2003/0108870 和 US7, 402, 386.如 Genom印Iex 和 Picoplex 的 PCR 扩增方法对不同基因位点有明显的偏向(不均一性) ，导致扩增后部分位点丢失。这些方法扩增的细胞产物常常只能测序5-30%的基因组序列。多个置换扩增法(MDA)利用低温扩增，可导致嵌合物的大量形成，这些非基因组本来的序列造成明显的测序假阳性结果以及测序人工假象。虽然全基因组扩增已经有开始尝试，但一般说来这些方法低效，复杂，费用贵。因此，需要发展一种从很少DNA量，比如说单细胞，扩增全基因组的有效方法。
技术实现思路
该专利涉及一种DNA扩增方法，该扩增方法使用少量基因组DNA，或少量基因组DNA序列，来自于人或其它物种的单细胞，或一种细胞的少数几个细胞，血液或体液。该扩增方法可以用单个反应管，在PCR扩增仪上进行扩增。该方法可用于由单细胞扩增的全基因组DNA的高通量测序，并取得相当的测序深度。该专利方法对单细胞全基因组的各不同位点进行高保真，高均一，高测序广度的扩增，扩增物用于高通量测序分析。该方法减少了测序偏向，从而能从单细胞提供出比较全面的，90 %以上，基因组DNA序列信息，在7x，IOx，或15x的测序深度时，可以测得70 %以上的基因组序列信息，并且基本没有嵌合物形成的影响。该方法避免了测序人工假象，推进了单个核苷酸多形性(SNP)，基因拷贝数多形性(CNV)，基因结构变化(SV)等高级基因组分析，及高通量基因测序分析。该 方法特别有用于有多个细胞群体的生物系统，如肿瘤，神经组织等。该专利方法所用弓丨物包含一段共同序列，一段可变序列，一段固定序列。DNA变性后单链的引物与单链模板在低温结合，然后在高温下扩增，使用至少一个具有链置换性能及3’端核酸核酸外切酶活性的聚合酶。在第二个扩增循环结束时，双链DNA(dsDNA)，一端有引物的序列结合，另一端有互补引物序列结合，变性产生单链DNA(ssDNA)。反应温度降低到可以使游离引物与单链扩增物的3 ’端杂交的温度，从而防止扩增物自身或相互之间杂交，再降温到适当温度完成引物的结合与下一个扩增循环。该专利方法可用于少量或微量DNA扩增，对样品DNA的多个部位进行核型分析或高通量筛选，可用于快速建立针对染色体特定区域的带特异性的探针，微解剖，或扩增未知染色体区域或已标记的异常染色体的标记染色体，用于扩增物的快速克隆或建立DNA库。因此该方法不仅对核型分析与高通量筛选有用，对细胞遗传诊断也有价值。该专利方法使用非常规PCR循环扩增方法从单个哺乳动物细胞扩增全基因组序列。某些DNA聚合酶能够产生典型的结果。可以增加一个扩增步骤让游离引物与扩增物上的互补序列结合，比如说3’端，从而防止扩增物自身或相互之间杂交，以至于嵌合物的形成，并提供了去除扩增物两端引物的方法。该专利方法扩增一个或几个细胞的全基因组序列。在使用示意中，首先分离单细胞，将之在一定体积的细胞裂解液中裂解，释放基因组DNA，裂解产物可以分成2亚份到10万亚份不等。DNA分离方法可以将同源的两个基因位点分与不同的亚份中，亚份数越多，同源DNA位点分与不同亚份的可能性越高。同源DNA的两个位点分与不同亚份可以用于基因组DNA半倍体的核型分析。不同亚份中的基因组组份可以扩增得到相应部分的基因组扩增物，用于测序分析。两个或两个以上，相同的或不同细胞，的样品可以当作单细胞样品处理分析。该专利方法扩增一个或几个细胞的全基因组序列。单细胞的遗传物质可以分成若干亚份，并分别进行扩增分析，从而实现单倍体或二倍体核型分析。该方法可用于没有参考基因组序列，或有复杂结构`变化的基因组的物种的全新基因组测序组装。该方法可采用不同来源的DNA，包括不均一组织，如肿瘤，罕见与珍贵样品，如胚胎干细胞，非分裂细胞，如神经元，等。也可以用于不同测序平台与核型分析方法。单倍体核型分析方法可参见下列文献:Levy, S.et al.The diploid genome sequence of an individualhuman.Plos Biol.5, e254 (2007) ；de Bakker, P.1.et al.A high-resolution HLA andSNP haplotype map for disease association studies in the extended humanMHC.Nat.Genet.38，1166-1172 (2006) ;Nagel，R.L.et al.The Senegal DNA haplotypeis associated with the amelioration of anemia in African-American sicklecell anemia patients.Blood77，1371-1375 (1991) ;Drysdale，C.M.et al.Complexpromoter and coding region beta2_adrenergic receptor haplotypes alterreceptor expression and predict in vivo responsiveness.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97,10483-10488 (2000) ;Sun，T.et al.Haplotypes in matrix metalloproteinasegene cluster on chromosome Ilq22contribute to the risk of lung cancerdevelopment and progression.Clin.Cancer Res.12，7009-7017(2008) ；Kitzman,J.0.etal.Haplotype-resoIved genome sequencing of a Gujarati Indian individual.Nat.Biotech.29,59-63(2011) ；International HapMap C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增单细胞全基因组的方法，包括：(a)在反应容器中提供单链形式的来自单细胞的基因组DNA；(b)向反应容器中加入具有共同序列、可变序列和固定序列的引物以产生反应混合物，(c)将所述反应混合物经受低温，所述引物至所述单链基因组DNA的退火在所述低温下发生，(d)向所述反应混合物中加入具有链置换活性或具有5’‑3’核酸外切酶活性的至少一种DNA聚合酶，并将所述反应混合物经受发生DNA扩增的温度，以产生单链或双链DNA，(e)将所述反应混合物经受产生单链扩增物的温度；(f)可选地将所述反应混合物经受退火游离引物至所述扩增物3’端的温度；(g)重复步骤(c)至(f)以产生所述基因组DNA的扩增物，以及(h)分析基因组DNA以分析先天性疾病或已知的表型后果，包括整个染色体水平异常、染色体易位、非整倍体、部分或全部染色体的缺失或复制、β‑地中海贫血、唐氏综合征、囊性纤维化、镰状细胞病、泰‑萨克斯病、脆性X综合征、脊髓性肌萎缩症、血红蛋白病、α‑地中海贫血、X连锁疾病(由X染色体上的基因主导的疾病)、脊柱裂、无脑畸形、先天性心脏病、肥胖、糖尿病、癌症、胎儿性别、胎儿RHD、胎儿HLA单倍型、父源突变、或染色体非整倍体。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢晓亮，宗诚航，陆思嘉，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，
类型：发明
国别省市：美国;US