涉及NS5B多肽和假结的HCV翻译或复制的调节剂的鉴定方法技术

本发明专利技术涉及充当丙肝病毒(HCV)翻译和/或复制的调节剂的化合物的鉴定方法，和通过该方法鉴定的化合物，以及所述化合物在医药中的应用。本发明专利技术还涉及可用于鉴定HCV翻译和/或复制的调节剂的RNA。本发明专利技术还涉及制备有复制能力的HCV病毒的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及充当丙肝病毒(HCV)翻译和/或复制的调节剂的化合物的鉴定方法，和通过该方法鉴定的化合物，以及所述化合物在医药中的应用。本专利技术还涉及可用于鉴定HCV翻译和/或复制的调节剂的RNA。本专利技术还涉及制备有复制能力的HCV病毒的方法。【专利说明】涉及NS5B多肽和假结的HCV翻译或复制的调节剂的鉴定方法
本专利技术涉及一种充当丙肝病毒(HCV)翻译和/或复制的调节剂的化合物的鉴定方法，以及通过该方法鉴定的化合物和所述化合物在医药中的应用。本专利技术还涉及用于鉴定HCV翻译和/或复制的调节剂的RNA。本专利技术还涉及产生有复制能力的HCV病毒的方法。
技术介绍
HCV是全世界重要的病毒病原体，感染全球约I亿7000万个体。如果急性感染没有得到清除，则病毒引起持续的肝病从而导致不可逆硬化，并且与每年超过100，000例肝细胞癌相关。在美国和欧洲，HCV引起的肝病是肝移植的主要适应症。由于目前没有对抗HCV的疫苗，并且病毒水平的变化使得有效候选物的前景不可靠，因此当前的治疗限于利巴韦林和PEG化的干扰素-α的组合。急需新的疗法。解析HCV基因组结构和功能的反向遗传学方法也受到数量有限的有的体外复制系统的妨碍。因此需要对HCV分子生物学进一步了解来辅助鉴定新的治疗靶标。
技术实现思路
本专利技术目标是涉及HCV病毒的RNA 二级结构的分子相互作用，从而鉴定能够调节HCV翻译和/或复制的化合物。对HCV病毒的RNA 二级结构的修饰还使得可以产生有复制能力的HCV病毒。本专利技术人令人惊讶地指出，涉及SL9266/PK假结(本文中也称为SL9266/PK)的分子相互作用对HCV翻译有作用。此相互作用还依赖于NS`5B多肽。对于给定化合物对HCV翻译的调节效果的鉴定也能鉴定对HCV复制的调节效果。因此，本专利技术提供了调节HCV翻译和/或复制的化合物的筛选方法。该方法利用包含SL9266/PK或其变体和NS5B多肽的RNA形式的上述分子相互作用中的组分。在这些组分的情况下确定了测试化合物对HCV翻译的效果。这提供了可有助于开发解决HCV感染的治疗策略的药物开发新方法。另外，本专利技术人还指出，对诸如SL9266/PK等HCV病毒的RNA 二级结构稳定性的修饰对于产生有复制能力的HCV可具有有益效果。这在允许提供用于分析HCV的改善的体外系统方面带来另一益处。因此，本专利技术提供一种调节丙肝病毒(HCV)翻译和/或复制的化合物的鉴定方法，所述方法包括:(a)使包含SL9266/PK假结或其变体和能够翻译的报告物编码序列的RNA在NS5B多肽或其变体的存在下与所述化合物接触；和(b)测定所述报告物编码序列的翻译。根据本专利技术的优选方面，所述方法还包括:(c)将步骤b)中测定的报告物编码序列的翻译与对于未与所述化合物接触的步骤a)中的RNA所获得的对照值进行比较，由此确定所述化合物是否是HCV翻译和/或复制的调节剂。本专利技术的方法可用于增强或抑制NS5B多肽对HCV翻译的阻遏的化合物的鉴定方法，或用于增加或减少HCV复制的化合物的鉴定方法，或用于适合于预防或治疗HCV感染的化合物的鉴定方法。在另一方面，本专利技术提供了一种包含SL9266/PK假结或其变体以及能够翻译的报告物编码序列的RNA。在优选实施方式中，所述RNA还包含能够翻译的NS5B或NS5B变体编码序列，可选的是其中所述报告物编码序列和NS5B或NS5B变体编码序列位于不同的顺反子。根据本专利技术，通过本专利技术的任何方法鉴定的HCV翻译和/或复制的调节剂可用于预防或治疗受试对象的HCV感染的方法，所述方法包括对所述受试对象施用有效量的HCV翻译和/或复制的调节剂。在又一方面，本专利技术提供一种产生有复制能力的HCV病毒的方法，所述方法包括:(a)确定HCV病毒基因组的一个或多个部分的RNA 二级结构的稳定性；(b)将所述RNA 二级结构的稳定性与JFH-1HCV病毒的对应结构的稳定性进行比较；和(c)按照与JFH-1HCV病毒的对应结构相似的方式在所述HCV病毒基因组中引入稳定所述RNA 二级结构的突变 ，由此产生有复制能力的HCV病毒。在另一方面，本专利技术提供一种包含8至48个核苷酸长度的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸与HCV的9266至9314中的部分或全部区域基本上互补。此类寡核苷酸可用于预防或治疗HCV感染。【专利附图】【附图说明】图1显示了在两种不同的体外HCV复制系统中对SL9266/PK结构的分析。(A)Conlb0 (B)JFH-10关键位置以~为前缀来指示特定核苷酸，并且相邻的茎环以反向图像显示，上游和“吻合环”相互作用以灰色阴影菱形标出。图2显示了 SL9266/PK和NS5B介导的翻译反馈的体外分析。(A)双顺反子报告物系统和带帽NS5BmRNA。星号表示工程化到双顺反子报告物版本中的终止密码子，称为NS5B-停止。(B)在左手侧列出的报告物存在下确定的相对于亲本双顺反子报告物标准化的荧光素酶活性。C9302A是SL9266/PK中的点突变。带帽NS5B mRNA以1:1至1:10摩尔过量反式补充。图3显示了对不同体外复制系统中SL9571的结构的分析。各条表示9566-9602区域中各核苷酸与显示出更大反应性的未配对核苷酸的化学反应性。反向箭头表示SL9571的推断的双链区域,虚线表示与SL9266形成‘吻合环’时涉及的顶环(apical loop)。(A)Conlb, (B)JFH-1和(C)具有破坏“吻合环”相互作用的G9583A突变的JFH-1。图4显示了在J6/JFH-1和Conlb中的长范围RNA序列与SL9266的相互作用的示意图和比较，以及标出了特定突变的影响。图5 和 6 分别显示了 Conlb 的 SL9266 和 SL9571 以及 JFH-1 的 SL9266 和 SL9571的结构和针对它们的寡核苷酸的另外的示意性分析。与实施例所用的寡核苷酸互补的HCV序列以粗体表示。图7显示了利用双顺反子报告物评价针对SL9266的寡核苷酸对翻译的效果的测试结果。1-5道利用了合成NS5B的报告物，6-10道利用了不合成NS5B的报告物。图8显示了评价针对SL9266和SL9571的寡核苷酸对亚基因组复制子复制的效果的测试结果。图9显示了在病毒复制测试中利用针对SL9571和SL9266的寡核苷酸的测试结果O序列说明SEQ ID NO:1是NS5B聚合酶的核酸序列。SEQ ID NO: 2是NS5B聚合酶的氨基酸序列。SEQ ID NO:3是双顺反子报告物构建体的核酸序列。SEQ ID N0:4是含有5’ HCV IRES的一部分的HCV核心蛋白编码序列区域的核酸序列。SEQ ID NO:5是与SL9571茎环互补的寡核苷酸的核酸序列。SEQ ID NO:6是Conlb抗-SL9266LNA寡核苷酸的核酸序列。.SEQ ID NO:7是随机化(randomised)LNA寡核苷酸的核酸序列。SEQ ID NO:8是JFH-1抗-SL9266LNA寡核苷酸的核酸序列。SEQ ID NO:9 是 Conlb/J`FH-Ι 抗-SL9571LNA 寡核苷酸的核酸序列。SEQ ID NO: 10 是 Conlb 核酸序列。SEQ ID NO: 11是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调节丙肝病毒(HCV)翻译和/或复制的化合物的鉴定方法，所述方法包括：(a)使包含SL9266/PK假结或其变体和能够翻译的报告物编码序列的RNA在NS5B多肽或其变体的存在下与所述化合物接触；和(b)测定所述报告物编码序列的翻译。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·J·埃文斯，P·西蒙兹，
申请(专利权)人：华威大学，爱丁堡大学评议会，
类型：发明
国别省市：英国;GB