人脂肪间充质干细胞提取物及其冻干粉和应用制造技术

本发明专利技术公开人脂肪间充质干细胞提取物及其冻干粉和应用，该人脂肪间充质干细胞提取物是取传代培养的P3～P30代人脂肪间充质干细胞，利用细胞生长液培养至细胞80%融合时，弃掉培养液，先用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，然后加入无血清培养液继续培养72小时后，收集无血清培养液，而未被收集的细胞利用消化液消化后，超声破碎仪破碎细胞，离心后收集上清；将收集的无血清培养液和收集的上清混合后，过滤，收集过滤液对其浓缩，再除菌处理后制备而得。本发明专利技术的人脂肪间充质干细胞提取物及其冻干粉具有多种生物学活性，可用于制备伤口愈合药物或细胞修复药物等生物医药产品，还可用于制备美白产品或皮肤抗皱产品等精细化工产品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞在生物医药或医学美容中使用的技术，尤其涉及人脂肪间充质干细胞在生物医药或医学美容中的使用。
技术介绍
脂肪组织来源广泛、取材容易、细胞分离效率高、给患者带来的创伤较少、并且不涉及伦理问题，因此日益受到广泛重视。人脂肪间充质干细胞是脂肪组织中的一类多能性干细胞，其能够分泌多种生物活性物质，包括蛋白质、多肽及细胞因子等，比如干细胞生长因子（SCGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、肝细胞生长因子（HGF）和转化生长因子等，这些细胞生长因子能够控制或者维持受伤组织细胞，引导其自身修复。除此之外，人脂肪间充质干细胞中还含有多种膜蛋白质及生物活性因子等多种成分，这些成分相互协调相互补充，具有复杂的生理作用，能够对许多组织器官产生影响，因此具有比较好的抗光老化、抗氧化、抗皱、美白肌肤、伤口愈合、细胞修复等功效。目前，虽然已有研究利用特定的诱导条件体外诱导干细胞分泌上清用于医疗、化妆品等方面，但是这种条件培养基是应用特定的细胞因子诱导干细胞分泌某些特定的因子从而达到疗效，细胞因子本身价格昂贵，使得干细胞的应用成本异常增高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有多种生物学活性，可用于生物医药、精细化工领域的人脂肪间充质干细胞提取物。本专利技术的另一个目的是提供上述人脂肪间充质干细胞提取物在制备伤口愈合药物或细胞修复药物等生物医药产品，或在制备美白产品或皮肤抗皱产品等精细化工产品中的应用。本专利技术的另一个目的是提供上述人脂肪间充质干细胞提取物的冻干粉。本专利技术的另一个目的是提供上述人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的制备方法。本专利技术的另一个目的是提供上述人脂肪间充质干细胞提取物的冻干粉在制备伤口愈合药物或细胞修复药物等生物医药产品，或在制备美白产品或皮肤抗皱产品等精细化工产品中的应用。本专利技术的上述目的是通过如下方案予以实现的：人脂肪间充质干细胞提取物，该提取物是由如下方法制备而得：步骤1.将人脂肪间充质干细胞经原代分离培养后，进行传代培养，取传代培养的P3～P30代人脂肪间充质干细胞，利用细胞生长液培养至细胞80%融合时，弃掉培养液，先用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，然后加入无血清培养液继续培养72小时后，收集无血清培养液，而未被收集的细胞进行后续处理；步骤2.将步骤1未被收集的细胞利用消化液消化后，超声破碎仪破碎细胞，离心后收集上清；步骤3、将步骤1收集的无血清培养液和步骤2收集的上清混合后，过滤，收集过滤液对其浓缩，所得浓缩液再进行除菌处理后，则制备得到所需人脂肪间充质干细胞提取物。上述步骤1中，所述将人脂肪间充质干细胞经原代分离培养中，原代分离方法和培养方法采用本领域技术人员的常规操作即可。上述步骤1中，所述细胞生长液是指含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，并且该培养液中还含有抗细菌抗生素；所述抗细菌抗生素为青霉素和链霉素两种，其中青霉素在细胞生长液中的终浓度为200 U/ml，链霉素在细胞生长液中的终浓度为250 U/ml；所述含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液为向市售的基础DMEM/F12培养液中加入终浓度为10%的胎牛血清，并加入终浓度为200 U/ml的青霉素和终浓度为250 U/ml的链霉素即为本专利技术的细胞生长液。上述步骤1中，所述磷酸盐缓冲液为pH值为7.0～7.2的PBS溶液。上述步骤1中，所述细胞在无血清培养液中继续培养72小时，这里的无血清培养液为市售产品。上述步骤1中，具体操作时，将传代培养的不同代细胞分别进行处理，如：将P3代的人脂肪间充质干细胞利用细胞生长液培养至细胞80%融合时，弃掉培养液，先用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，然后将细胞加入到无血清培养液中继续培养72小时后，收集得到P3的无血清培养液；将P4代的人脂肪间充质干细胞利用细胞生长液培养至细胞80%融合时，弃掉培养液，先用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，然后将细胞加入到无血清培养液中继续培养72小时后，收集得到P4代的无血清培养液等等；然后将P3～P30代人脂肪间充质干细胞分别得到的无血清培养液收集合并后，则得到实施例1收集的无血清培养液；同时，将P3～P30代人脂肪间充质干细胞分别得到的未被收集的细胞收集合并后，一起进行后续处理。上述步骤2中，所述消化液为0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液，该混合消化液先经0.22μm的滤膜过滤除菌后才能用于本专利技术；所述0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液为本领域技术人员进行细胞实验时常用的一种消化液，其配制方法按照教科书上给出的配制方法，均可实现本专利技术；如可采用如下方法配制：取0.25g胰蛋白酶粉、20mgEDTA粉末和100ml 0.01mol/L的PBS，先用少量PBS溶解胰蛋白酶粉，然后将EDTA粉末和其余的PBS加入混合后，置于37℃水浴中，待彻底溶解液体呈透明为止，用G5抽滤，分装置于4℃冰箱中保存即可。上述步骤2中，所述超声破碎仪破碎细胞，其破碎条件为4℃、400W、超声3s、间隔6s，99个循环。上述步骤2中，所述离心为17000g、30min。上述步骤3中，所述将步骤1收集的无血清培养液和步骤2收集的上清混合，这里步骤1收集的无血清培养液和步骤2收集的上清的混合比例为1:1，体积比。上述步骤3中，所述过滤是采用孔径为0.45μm的滤膜过滤。上述步骤3中，所述浓缩是采用截留分子量为3KD的过滤膜进行浓缩脱盐。上述步骤3中，所述浓缩是指浓缩至原体积的1/10，也就是说，将过滤液浓缩后得到浓缩液，所述浓缩液的体积是过滤液的1/10。上述步骤3中，所述将浓缩液进行除菌处理，这里的除菌处理是将浓缩液采用无菌的0.22μm滤膜过滤除菌。上述制备的人脂肪间充质干细胞提取物经过实验研究证实，其具有很多种生物学活性，可用于制备伤口愈合药物或细胞修复药物等生物医药产品，还可用于制备美白产品或皮肤抗皱产品等精细化工产品。本专利技术的人脂肪间充质干细胞提取物虽然具有多种生物学活性，应用领域广泛，但是其生物学活性受各种外界条件限制，保存起来不方便，因此本专利技术还提供人脂肪间充质干细胞提取物的冻干粉，该冻干粉就是将本专利技术的人脂肪间充质干细胞提取物经本领域常用的冻干粉制备方法制备的冻干粉；冻干粉是在无菌环境下将药液冷冻成固态，抽真空将水分升华干燥而成的无菌粉，冻干粉的制备方法是本领域比较成熟的技术，本专利技术采用任何一种冻干粉的制备方法，都可以得到所需的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉。为了取得更好的医药学效果，本专利技术还特别针对上述人脂肪间充质干细胞提取物的特点，研发了人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的制备方法，该制备方法包括如下步骤：向人脂肪间充质干细胞提取物中加入赋形剂和水，混合后过滤除菌，然后进行冻干处理，则制备得到所需人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉。上述冻干粉的制备方法中，所述赋形剂采用甘露醇、海藻糖或蔗本文档来自技高网...

【技术保护点】
人脂肪间充质干细胞提取物，其特征在于该人脂肪间充质干细胞提取物是由如下方法制备而得：步骤1.将人脂肪间充质干细胞经原代分离培养后，进行传代培养，取传代培养的P3～P30代人脂肪间充质干细胞，利用细胞生长液培养至细胞80%融合时，弃掉培养液，先用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，然后加入无血清培养液继续培养72小时后，收集无血清培养液，而未被收集的细胞进行后续处理；步骤2.将步骤1未被收集的细胞利用消化液消化后，超声破碎仪破碎细胞，离心后收集上清；步骤3、将步骤1收集的无血清培养液和步骤2收集的上清混合后，过滤，收集过滤液对其浓缩，所得浓缩液再进行除菌处理后，则制备得到所需人脂肪间充质干细胞提取物。

【技术特征摘要】
1.人脂肪间充质干细胞提取物，其特征在于该人脂肪间充质干细胞提取物是由如下方法制备而得：
步骤1.
将人脂肪间充质干细胞经原代分离培养后，进行传代培养，取传代培养的P3～P30代人脂肪间充质干细胞，利用细胞生长液培养至细胞80%融合时，弃掉培养液，先用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，然后加入无血清培养液继续培养72小时后，收集无血清培养液，而未被收集的细胞进行后续处理；
步骤2.
将步骤1未被收集的细胞利用消化液消化后，超声破碎仪破碎细胞，离心后收集上清；
步骤3、
将步骤1收集的无血清培养液和步骤2收集的上清混合后，过滤，收集过滤液对其浓缩，所得浓缩液再进行除菌处理后，则制备得到所需人脂肪间充质干细胞提取物。
2.根据权利要求1所述人脂肪间充质干细胞提取物，其特征在于所述步骤1中，细胞生长液是指含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，该培养液中还含有终浓度为200 U/ml的青霉素和终浓度为250 U/ml的链霉素。
3.根据权利要求1所述人脂肪间充质干细胞提取物，其特征在于所述步骤2中，消化液为经0.22μm的滤膜过滤除菌的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液。
4.根据权利要求1所述人脂肪间充质干细胞提取物，其特征在于所述步骤2中，超声破碎仪破碎细胞的条件为4℃、400W、超声3s、间隔6s，99个...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，舒辉萍，刘秋英，马岩岩，
申请(专利权)人：广州赛莱拉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：