一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，包括以SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物，以及还可以包括如SEQ ID No.4所示的荧光探针，该对引物所基于的序列高度保守、高度特异性，可选择性地扩增腐皮镰刀菌，从而将其与常见的同镰刀菌属其它菌种分离开来。基于该对引物的试剂盒和PCR检测方法，具有较高的特异性、灵敏性和操作便利性。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法
本专利技术涉及一种基因工程
，尤其涉及一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法。
技术介绍
腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)是植物根腐病的主要致病菌，主要对黄芪、丹参、甘草、板蓝根等产生危害。根腐病是一种真菌引起的植物病，该病会造成根部腐烂，导致植物吸收水分和养分的功能逐渐减弱，最后全株死亡，主要表现为整株叶片发黄、枯萎。腐皮镰刀菌根据其形状、厚垣孢子和长管瓶的存在确定其为大分生孢子，然而形态学鉴定不能区分不同的生物物种和具有共同形态特征而基因多样的有丝分裂菌株，如若采用传统的鉴定方法，容易出现偏差，且耗时较长。多重PCR检测腐皮镰刀菌虽然特异性好、准确性高，然而其PCR结果需要通过琼脂糖电泳进行分析，影响因素较多。随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量PCR目前已广泛应用于菌种的检测。其与常规的分离培养方法相比，具有耗时短、操作简便、特异性好的特点，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的污染。腐皮镰刀菌与其它镰刀属菌种有着较高的同源性，如尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌，为实现PCR反应的高度特异性，需要选择高度保守、特异的序列作为耙序列。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供高特异性的用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组。本专利技术的目的之二在于提供一种用于检测腐皮镰刀菌的试剂盒。本专利技术的目的之三在于提供一种用于检测腐皮镰刀菌的方法。本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，包括以SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物。进一步地，还包括如序列表SEQIDNo.4所示的探针，所述探针为荧光标记探针。进一步地，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：一种用于检测腐皮镰刀菌的试剂盒，包括如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物和如序列表SEQIDNo.4所示的探针。进一步地，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。进一步地，还包括阳性质粒的标准品，所述阳性质粒的标准品是以腐皮镰刀菌的DNA为模版、经过如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物PCR扩增回收，与pMD18-T质粒进行连接、转染后得到的。本专利技术的目的之三采用以下技术方案实现：一种用于检测腐皮镰刀菌的方法，包括以下步骤：1)获得阳性质粒的标准品：以腐皮镰刀菌的DNA为模版、经过如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物PCR扩增回收，与pMD18-T质粒进行连接、转染后得到阳性质粒的标准品；2)PCR鉴定：分别以待测样品的DNA、阳性质粒的标准品为模板，以ddH2O为阴性对照，通过如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物进行PCR反应检验。进一步地，步骤2)中，PCR反应体系为：10×PCRbuffer2.5μL、dNTP(2.5μM)0.5μL、上游引物(1μM)0.5μL、下游引物(1μM)0.5μL、模板0.5μL、Taq酶(5U)0.5μL和ddH2O补足25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s、50℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。进一步地，步骤2)中，PCR扩增体系包括如序列表SEQIDNo.4所示的探针。进一步地，PCR反应体系：2×premix10μL、上游引物(10μM)0.2μL、下游引物(10μM)0.2μL、探针(10μM)0.2μL、模板0.3μL、ddH2O补足至20μL。PCR反应条件：94℃预变性2分钟，94℃10秒、60℃30s并收集荧光信号，40个循环。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法，主要是以对腐皮镰刀菌高度保守的特异性的Fstef1基因作为耙序列，设计如SEQIDNo.2所示的上游引物和如SEQIDNo.3所示的下游引物，该序列的扩增长度为215bp，其对腐皮镰刀菌具有较好的特异性，能有效地将其与同镰刀菌属的尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌区分开来；本专利技术同时还提供了与如SEQIDNo.2所示的上游引物和如SEQIDNo.3所示的下游引物相对应的探针，该探针可应用于一步荧光法定量分析样品中腐皮镰刀菌，其具有较高的灵敏度和特异性；基于上述上、下游引物和探针的试剂盒和方法，具有较便捷的操作性和较高的灵敏度、特异性。附图说明图1为实施例1耙序列的Blast结果图；图2为实施例1上下引物序列的Blast结果图；图3为实施例5的标准曲线图；图4为实施例7的灵敏度试验曲线；其中，a代表质粒浓度为1.00×107copies/μL、b代表质粒浓度为1.00×106copies/μL、c代表质粒浓度为1.00×105copies/μL、d代表质粒浓度为1.00×104copies/μL、e代表质粒浓度为1.00×103copies/μL、f代表质粒浓度为1.00×102copies/μL、g代表质粒浓度为1.00×101copies/μL和阴性对照。图5为实施例7的特异性试验曲线；其中，a标准扩增曲线为腐皮镰刀菌基因组，b代表未出现标准扩增曲线分别为尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌、阴性对照；图6为实施例8的特异性试验结果图；其中，泳道1-6依次为尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌、阴性对照、DL2000的Marker。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。本专利技术以高度保守、特异的Fstef1基因作为耙序列，设计PCR扩增引物和探针，再采用PCR技术扩增腐皮镰刀菌Fstef1基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-Fstef1，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。本专利技术提供一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，该核苷酸序组包括以SEQIDNo.1为耙序列设计的引物对：如SEQIDNo.2所示的上游引物；和如SEQIDNo.3所示的下游引物。其中，SEQIDNo.1耙序列如下所示：其中，直线下划线部分的序列为SEQIDNo.2所示的上游引物序列，而波浪线下划线部分的序列与SEQIDNo.3所示的下游引物序列相匹配。SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物的扩增片断大小为215bp。SEQIDNo.1耙序列通过对NCBI数据库blast结果显示如图1，其与多种腐皮镰刀菌分离菌株的Fstef1基因序列的匹配度高、相似度达100％。上游引物和下游引物序列经NCBI中Primer-Blast比对结果见图2。由图2可知，此对引物对腐皮镰刀菌具有特异性。该核苷酸序组包括如SEQIDNo.4所示的探针序列：耙基因点下划线部分与所述探针序列相对应。探针序列的荧光报告基团本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，其特征在于，包括以SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，其特征在于，包括以SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物。2.如权利要求1所述的用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，其特征在于，还包括如序列表SEQIDNo.4所示的探针，所述探针为荧光标记探针。3.如权利要求2所述的用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，其特征在于，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。4.一种用于检测腐皮镰刀菌的试剂盒，其特征在于，包括如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物和如序列表SEQIDNo.4所示的探针。5.如权利要求4所述的检测腐皮镰刀菌的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。6.如权利要求4所述的检测腐皮镰刀菌的试剂盒，其特征在于，还包括阳性质粒的标准品，所述阳性质粒的标准品是以腐皮镰刀菌的DNA为模版、经过如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物PCR扩增回收，与pMD18-T质粒进行连接、转染后得到的。7.一种用于检测腐皮镰刀菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获得阳性质粒的标准品：以腐皮镰刀菌的DNA为模版、经过如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，徐红，李琳，沈颂东，曲静，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32