一种大豆HRM-SNP分子标记点标记方法及其应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种大豆HRM‑SNP分子标记点标记及其应用，进行大豆SNP标记的开发、浙鲜九号基因组DNA提取、高分辨率熔解曲线过程与分析、浙鲜九号基于HRM技术的SNP分型、浙鲜九号HRM分型验证、浙鲜九号SNP指纹图谱的构建。本发明专利技术具有高通量、分析时间短：一次可同时完成对96个或384个样品的分析，适合大规模开发和检测SNP位点；本发明专利技术操作简便，无需序列特异性探针以及后续测序，只需要设计PCR引物，进行PCR反应，接着直接进行HRM，便可完成对样品的基因型分析；本发明专利技术特异性好：PCR产物无需后续处理，完全闭管操作。

【技术实现步骤摘要】
一种大豆HRM-SNP分子标记点标记方法及其应用
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种大豆HRM-SNP分子标记点标记方法及其应用。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：到目前为止，进行SNP分型检测方法已有20多种。依据是否需要凝胶电泳以及自动化程度的高低，可以把SNP的检测方法大致分为两大类，一是基于凝胶电泳的SNP检测方法，像单链构象多态性(Single-StrandConformationalPolymorphism，SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DenaturedGradientGelElectrophoresis，DGGE)、裂解扩增多态性序列分析(CleavedAmplifiedPolymorphicSequences，CAPS)、等位基因特异PCR(AlleleSpecificPCR，AS-PCR)等；二是高通量、自动化程度较高的SNP检测方法，像直接测序、DNA芯片、变性高效液相色谱分析技术(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography，DHPLC)、质谱检测、高分辨率熔解曲线(High-resolutionMelting，HRM)等。以上检测SNP方法各有优缺点，有的能精确检测出SNP位点，如DNA测序、DNA芯片技术，但其成本昂贵，不能普遍运用；有的操作复杂，耗时费力，如AS-PCR技术；有的高通量、成本低、结果准确，但对设备硬件要求较高，如HRM技术。理想的SNP检测法应具有如下特点：灵敏度以及准确度高；快速、简便、高通量；费用相对低廉。但到目前为止还没有完全符合以上特点的检测方法出现，因此可依据实际情况，选择较适宜的方法。大豆是我国主要的油料和经济作物，已有五千多年的种植历史。因营养丰富、风味较好、经济效益高，且采收、加工、销售等形式多样化，而风靡中国、日本等亚洲国家。虽然大豆起源于我国，但发展较晚，早期育种主要以从台湾省或者日本引进优异品种进行筛选或杂交选育为主，导致育种资源遗传基础较窄，不利于新品种的开发。而目前主要用于大豆各类研究的简单序列重复(SSR，SimpleSequenceRepeat)标记，也存在数量相对较少、分析操作复杂、标记大小不易确定而无法跨研究使用等不利因素。高分辨率熔解曲线(high-resolutionmelting，HRM)技术是一种新型的SNP检测技术。近年来，随着该技术的不断发展完善，已被成功应用到基因分型、突变扫描、甲基化研究等多个方面，并且在马铃薯、苜蓿、柑橘等作物研究中得以成功地应用。因而，开发密度更高、分析更简便、基因型确定可以跨研究使用的SNP新型分子标记，具有非常重要的应用价值。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)目前主要用于大豆各类研究的简单序列重复(SSR，SimpleSequenceRepeat)标记，也存在数量相对较少、分析操作复杂、标记大小不易确定而无法跨研究使用等不利因素。(2)由于大豆基因组异常复杂，HRM技术本身对引物设计的要求比较高，在进行引物设的计过程中，经常会遇到SNP位点序列在基因组中不是唯一的、或者设计的引物有非特异扩增的情况。解决上述技术问题的意义：相较于前两代DNA分子标记，SNP标记具有较高的遗传稳定性，高密度以及检测快速，易实现自动化分析等显著特点，SNP在大豆基因组中具有很高的分布频率，平均每273bp就存在1个SNP，是加密大豆遗传图谱、重要性状QTL定位、分子标记辅助选择的重要手段。用Primer-BLAST进行引物设计可以保证扩增的特异性和引物设计的高成功率。由于大量SNP位点在初步引物设计过程中被丢弃并取代，所以粗略估计引物设计的最终成功率高于85％。这101个SNP标记均匀分布在大豆20条染色体上，研究中可以直接使用这些标记，也可以通过使用本专利技术上述方法不断在两个相邻SNP位点之间开发新标记来提高标记密度，也可作为已知基因组信息的其他作物的参考。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种大豆HRM-SNP分子标记点标记方法及其应用。本专利技术是这样实现的，一种大豆HRM-SNP分子标记点标记方法，包括：第一步：大豆SNP标记的开发：使用数据库中的Genome浏览器工具从Williams82物理图谱中每10Mb选择一个SNP标记，每条染色体选择4～6个SNP，均匀分布于大豆基因组20条染色体上,获取每个SNP标记的详细信息；第二步：大豆(浙鲜九号)基因组DNA提取:根据CTAB法提取浙鲜九号幼嫩叶片的基因组DNA，并稀释至25ng·μL-1，保存于-20℃冰箱以备后续HRM分析使用；第三步：高分辨率熔解曲线过程与分析：在定量PCR仪上进行PCR扩增和HRM分析；高分辨率熔解曲线分析采用480软件的GeneScanning模块进行，获得更好的标准化熔解曲线；第四步：大豆(浙鲜九号)基于HRM技术的SNP分型：浙鲜九号DNA在定量PCR仪内进行扩增和HRM分析；第五步：大豆(浙鲜九号)号HRM分型验证：随机对部分SNP标记的PCR产物进行Sanger测序，验证HRM分析的准确性；第六步：大豆(浙鲜九号)SNP指纹图谱的构建：第六步：大豆(浙鲜九号)SNP指纹图谱的构建：以“Williams82”为对照，利用开发的101个SNP标记对菜用大豆“浙鲜9号”进行HRM分型，并将分型结果按照染色体编号－物理图距从小到大的顺序依次列出。比如从第1号染色体第1个标记到第20号染色体最后一个标记的分型结果为：“AGTTCC……GGA”，则这一串字母即为“浙鲜9号”的DNA指纹。所以浙鲜九号的SNP图谱为TCAACTAGCCACTGCTCCTAGATGACCGCGATGGGGTGGGCCACCATCACTTCTTCTGGTTACCATACCGTGGCGAGGTCTAAACGATCTCCTCTGCTACT。进一步，大豆(浙鲜九号)基因组DNA提取中，根据改进的CTAB法提取浙鲜九号幼嫩叶片的基因组DNA，并稀释至25ng·μL-1，保存于-20℃冰箱以备后续HRM分析使用，具体步骤包括：(1)提取缓冲液2％CTAB，100mmol·L-1Tris-HCL，pH8.0；20mmol·L-1EDTA；2％PVP；1.4mol·L-1Nacl，使用前加入0.2％的巯基乙醇，预热至65℃；(2)取新鲜叶片0.05g，适当剪碎后放入2.0ml离心管中，加入1颗直径5mm钢珠，2-3颗2mm小钢珠；(3)在含样品和钢珠的离心管中加入1.0mL预热的提取缓冲液，盖好离心管盖，装入适配器后在TissueLyser-192磨样机中研磨60秒；(4)取出离心管，65℃水浴10-30min。然后取出离心管，1200rpm离心5-10min；(5)取1mL上清液到新的2mL离心管中，加入700μL按体积比酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，缓慢颠倒混匀数次；室温，1200rpm离心5-10min；(6)取800μL上清液到新的2mL离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇＝24:1，缓慢颠倒混匀数次；室温，1200rpm离心5-10min；(7)取600μL上清液到新的1.5mL离心管中；加入400μL预冷的异丙醇，缓慢颠倒混匀，置于-20℃冰箱放置30min；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大豆HRM‑SNP分子标记点标记方法，其特征在于，所述大豆HRM‑SNP分子标记点标记方法包括：大豆SNP标记的开发：使用数据库中的Genome浏览器工具从Williams 82物理图谱中每10Mb选择一个SNP标记，每条染色体选择4～6个SNP，均匀分布于大豆基因组20条染色体上,获取每个SNP标记的详细信息；大豆基因组DNA提取:根据改进的CTAB法提取大豆幼嫩叶片的基因组DNA，并稀释至25ng·μL‑1，保存于‑20℃冰箱以备后续HRM分析使用；高分辨率熔解曲线过程与分析：在定量PCR仪上进行PCR扩增和HRM分析；高分辨率熔解曲线分析采用

【技术特征摘要】
1.一种大豆HRM-SNP分子标记点标记方法，其特征在于，所述大豆HRM-SNP分子标记点标记方法包括：大豆SNP标记的开发：使用数据库中的Genome浏览器工具从Williams82物理图谱中每10Mb选择一个SNP标记，每条染色体选择4～6个SNP，均匀分布于大豆基因组20条染色体上,获取每个SNP标记的详细信息；大豆基因组DNA提取:根据改进的CTAB法提取大豆幼嫩叶片的基因组DNA，并稀释至25ng·μL-1，保存于-20℃冰箱以备后续HRM分析使用；高分辨率熔解曲线过程与分析：在定量PCR仪上进行PCR扩增和HRM分析；高分辨率熔解曲线分析采用480软件的GeneScanning模块进行，获得更好的标准化熔解曲线；大豆基于HRM技术的SNP分型：大豆DNA在定量PCR仪内进行扩增和HRM分析；大豆HRM分型验证：随机对部分SNP标记的PCR产物进行Sanger测序，验证HRM分析的准确性；大豆SNP指纹图谱的构建：以Williams82为对照，利用开发的101个SNP标记对菜用大豆进行HRM分型，并将分型结果按照染色体编号－物理图距从小到大的顺序依次列出。2.如权利要求1所述的大豆HRM-SNP分子标记点标记方法，其特征在于，大豆基因组DNA提取中，大豆为浙鲜九号，根据改进的CTAB法提取浙鲜九号幼嫩叶片的基因组DNA，并稀释至25ng·μL-1，保存于-20℃冰箱以备后续HRM分析使用，具体步骤包括：(1)提取缓冲液2％CTAB，100mmol·L-1Tris-HCL，pH8.0；20mmol·L-1EDTA；2％PVP；1.4mol·L-1Nacl，使用前加入0.2％的巯基乙醇，预热至65℃；(2)取新鲜叶片0.05g，适当剪碎后放入2.0ml离心管中，加入1颗直径5mm钢珠，2～3颗2mm小钢珠；(3)在含样品和钢珠的离心管中加入1.0mL预热的提取缓冲液，盖好离心管盖，装入适配器后在TissueLyser-192磨样机中研磨60秒；(4)取出离心管，65℃水浴10-30min。然后取出离心管，1200rpm离心5-10min；(5)取1mL上清液到新的2mL离心管中，加入70...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋江华，裴佳星，董德坤，朱丹华，杨清华，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34