鉴定烟草sua-CMS胞质雄性不育系的分子标记制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴定烟草sua‑CMS胞质雄性不育系的分子标记，选自orf82、orf103、orf115

【技术实现步骤摘要】
鉴定烟草sua-CMS胞质雄性不育系的分子标记
本专利技术涉及一种鉴定烟草sua-CMS胞质雄性不育系的分子标记，及鉴定方法，属于生物

技术介绍
植物细胞质雄性不育(cytoplasmicmalesterility，CMS)是雄蕊退化、花粉败育或功能不育等原因造成的雄蕊不能正常授粉而雌蕊功能正常的一种母性遗传性状。雄性不育系是作物杂种优势利用的前提，也是提高单产、改进品质、增强抗逆的重要途径。烟草是叶用作物，在杂交育种中使用不育系不但可以克服人工去雄授的缺点，在生产上使用不育系还能够控制种子的私自繁殖，保证烟草种子质量，维持正常的烟草生产秩序，因此烟草细胞质雄性不育在烟草育种和生产上具有很重要的地位。近年来，烟草不育系及杂交种的种植面积占我国烤烟面积的50％以上，均为sua-CMS类型，sua-CMS也是唯一一个对烟草综合性状无不利影响的不育类型(佟道儒、马文广等)。一般不育类型通过形态学、细胞学以及分子特征等方面进行鉴定，特异分子的鉴定具有稳定性、准确性和快速性等优点，可以广泛应用于不育类型鉴定。目前尚未见到有关鉴定烟草sua-CMS胞质雄性不育系的分子标记的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种鉴定烟草sua-CMS胞质雄性不育系的分子标记，及鉴定方法，能够快速鉴定烟草sua-CMS，大幅减少了鉴定工作量，节省了时间和资金，提高了工作效益。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种鉴定烟草sua-CMS胞质雄性不育系的分子标记，所述分子标记选自orf82、orf103、orf115a、orf100、orf115b、orf191，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、2、3、4、5、6所示。本专利技术通过对线粒体基因大量扩增和筛选，利用ORF-Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，BLASTN，BLASTX(Altschul等，1990)和tRNAscan-SE(Lowe和Eddy1997)在不育系和可育对照的线粒体基因组中筛选ORF>70的ORFs，在不育系和可育系中分别发现了393和417个ORF。通过BLAST比对，其中的362个ORF为不育系和可育对照共有，将sua-CMS不育系特有的31个ORF设计特异引物，在7种烟草胞质不育类型中进行扩增，发现位于122845-123313、372705-343743、414430-415454三个区段内的orf82、orf103、orf115a、orf100、orf115b、orf191共6个ORF(核苷酸序列依次如SEQIDNO.1～6所示)是sua-CMS不育系特有的(如图2所示)(这6个ORFs位于三个区段内，orf82位于区段一内，orf103、orf115a位于区段二内，orf91、orf115b、orf100位于区段三内)。三对特异性引物，可特异性扩增上述鉴定烟草sua-CMS胞质雄性不育系的分子标记(引物sp1、sp2、sp3分别对应上述的三个区段122845-123313、372705-343743、414430-415454)，其核苷酸序列分别如下所示(序列方向为5′-3′)：sp1：F：GCAGAGGTGACAAAGCAT；R：GAAACCAAACAAAGAGCG(核苷酸序列如SEQIDNO.7、8所示)。sp2：F：GGAGTTCCCCCCTTGAAG；R：CGGTGCCGAAGTTTGGTT(核苷酸序列如SEQIDNO.9、10所示)。sp3：F：ATCAGGACGGTAGCACTT；R：GGTCTTTCCCAAAACAAA(核苷酸序列如SEQIDNO.11、12所示)。上述鉴定烟草sua-CMS胞质雄性不育系的分子标记、特异性引物在鉴定烟草sua-CMS胞质雄性不育系中的应用。具体应用时，鉴定方法包括如下步骤：(1)提取待检测烟草的叶片基因组DNA；(2)以叶片基因组DNA为模板，利用上述的三对特异性引物之一进行扩增，检测扩增产物，若扩增出特异性条带(引物sp1扩增出468bp的特异性条带，引物sp2扩增出1038bp的特异性条带，引物sp3扩增出1024bp的特异性条带)，则该待检测烟草为sua-CMS胞质雄性不育系。进一步地，提取叶片基因组DNA后，利用1％的琼脂糖检测DNA的完整性(鉴定DNA有无降解)，并利用Nanodrop测定所提DNA浓度和质量(通过仪器测定OD260/280的比值，鉴定DNA有无蛋白或者RNA的污染以及所提DNA的浓度)。研究细胞质雄性不育的分子机理对创建、鉴定和利用细胞质雄性不育系，培育超高产杂交作物新品种具有重要的指导意义。目前研究表明，线粒体基因组是细胞质雄性不育胞质因子的主要载体，烟草细胞质雄性不育与线粒体有着十分密切的关系，线粒体基因组的变异性很可能涉及到不育系育性本质的改变，本专利技术通过对线粒体基因大量扩增和筛选，得到了烟草sua-CMS的六个特异ORFS，进一步实验证明这六个ORFS分布在线粒体基因的三个区段上。本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术的鉴定方法，避免了繁琐的线粒体DNA的提取，以烟草叶片基因组DNA为模板，利用内参和线粒体基因组内参进行叶片基因组DNA质量检测，扩增成功表示质量高，确保下一步扩增可靠实现。(2)本专利技术获得了sua型烟草细胞质的特异标记，鉴定方法高效并且程序简化，结果可用于sua型烟草细胞质雄性不育系分子标记辅助育种，也为烟草专一细胞质种性鉴定提供了技术支撑和理论依据。(3)本专利技术采用三对引物鉴定sua型烟草细胞质雄性不育系，为进一步研究烟草核质互作雄性不育机理，甚至种性差异奠定了基础。本专利技术所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本专利技术不一致时，以本专利技术的表述为准。此外，本专利技术使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。附图说明图1：实验用材料列表。图2；六个分子的结构简图。图3：sua-CMS特异引物的PCR扩增，其中，a、b、c分别对应引物sp1、sp2、sp3的扩增结果。图4：不同胞质来源的不育系的PCR扩增，其中，a、b、c分别对应引物sp1、sp2、sp3的扩增结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。然而，本专利技术的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本专利技术的精神和范围的前提下，可以对本专利技术进行各种变化和修饰。下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。实施例1本专利技术以七种烟草不同细胞质类型的雄性不育系和保持系为材料，分别是sua-CMS、glu-CMS、rep-CMS、rus-CMS、tab1-CMS、tab2-CMS、tab3-CMS和zhongyan100，分别提取其叶片基因组DNA，然后对其进行特异性标记筛选，获得sua型烟草胞质雄性不育的独特分子标记。sua型烟草胞质雄性不育的鉴定，步骤如下：(一)提取各种细胞质雄性不育系(sua-CMS、glu-CMS、rep-CMS、ru本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定烟草sua‑CMS胞质雄性不育系的分子标记，其特征在于：所述分子标记选自orf82、orf103、orf115a、orf100、orf115b、orf191，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6所示。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定烟草sua-CMS胞质雄性不育系的分子标记，其特征在于：所述分子标记选自orf82、orf103、orf115a、orf100、orf115b、orf191，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、2、3、4、5、6所示。2.根据权利要求1所述的鉴定烟草sua-CMS胞质雄性不育系的分子标记，其特征在于：所述分子标记orf82的特异性引物为sp1，其核苷酸序列为：F：GCAGAGGTGACAAAGCAT；R：GAAACCAAACAAAGAGCG；所述分子标记orf103、orf115a的特异性引物为sp2，其核苷酸序列为：F：GGAGTTCCCCCCTTGAAG；R：CGGTGCCGAAGTTTGGTT；所述分子标记orf100、orf115b、orf191的特异性引物为sp3，其核苷酸序列为：F：ATCAGGACGGTAGCACTT；R：GGTCTTTCCCAAAACAAA。3.权利要求1或2所述的鉴定烟草sua-CMS胞质雄性不育系的分子标记在鉴定烟草sua-CMS胞质雄性不育系中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：具体应用时，包括如下步骤：(1)提取待检测烟草的叶片基因组DNA；(2)以叶片基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的三对特异性引物之一...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凤霞，杨爱国，郑业强，刘志文，孙玉合，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37