一种利用SSR指纹图谱鉴别柿大茶品种的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用SSR指纹图谱鉴别柿大茶品种的方法，所涉及的茶树全基因组中特异的SSR位点及其两侧的保守序列如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:3。利用四份柿大茶优良品种作为样本材料，包括柿大茶1号、柿大茶2号、柿大茶6号和柿大茶黄种，在茶树全基因组中选取450对SSR引物进行多态性筛选，鉴定的流程主要有茶树总DNA提取、引物的设计、PCR扩增、等位基因多态性统计，最终确立了1对引物作为种鉴定的核心引物，有效的将四种柿大茶品种完全区分开，不仅有利于对柿大茶品种的保护和推广，同时，为市场上出售的各种宣称以柿大茶鲜叶为原料制成的茶叶，提供了一个快速、准确的鉴别方法。

【技术实现步骤摘要】
一种利用SSR指纹图谱鉴别柿大茶品种的方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种利用SSR指纹图谱鉴别柿大茶品种的方法。
技术介绍
柿大茶，安徽省省级茶树良种。有性繁殖系，是黄山区太平猴魁茶产地所特有的茶树品种，属灌木型，大叶类，中芽种。是适制传统十大名茶中太平猴魁的最佳品种，也是发展太平猴魁茶生产的必要条件之一。柿大茶植株适中，树姿半张开，分枝较稀，节间较短，叶片稍上斜状生长，叶片肥厚，叶椭圆形似肺叶，叶色深绿，富光泽，叶面隆起，叶质柔软。芽叶生育力强，持嫩性好。抗寒性、适应性强，结实性弱，适合生长在地山丘陵地带，每亩产量100Kg左右。茶叶富含营养物质，春茶一芽二叶干样约含氨基酸3.6％、茶多酚23.8％、儿茶素总量13.6％、咖啡碱4.0％。适制绿茶，制太平猴魁，外形挺直，扁平匀整，魁伟重实，色苍绿，全身白毫，含而不露，叶脉呈“红丝线”，茶汤杏绿清亮，幽香，滋味醇厚爽口，叶底黄绿明亮，肥厚柔软。是名茶太平猴魁不可替代的制作原料。这几年我国名优茶的需求不断增多和茶树新品种的不断培育成功，仅柿大茶就已培育出柿大茶1号、柿大茶2号、柿大茶6号和柿大茶黄种等诸多新品种，以不同柿大茶制作出的名优绿茶，在品质和售价上也不尽相同，消费者仅凭肉眼很难从外观形态上是区分其真假以及制作原料的区别。随着国家对植物新品种保护制度不断的完善，越来越多的育种者对新品种权保护的意识增强，积极申请新品种保护。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用SSR指纹图谱鉴别柿大茶品种的方法，利用SSR指纹图谱技术将四种柿大茶区分开来，在DNA水平上给四种柿大茶品种一个独特的指纹身份，从而达到保护柿大茶优良品种权的目的，将有利于对柿大茶优良品种的保护和推广，也为市场上出售柿大茶的真伪鉴别提供了一个快速、准确的方法。其具体技术方案为：一种利用SSR指纹图谱鉴别柿大茶品种的方法，涉及茶树基因组中一个特异的微卫星SSR位点，该位点的重复单元是由六碱基组成，其变异程度在茶树基因组中最高，特异位点SSR位点序列如SEQIDNO:1所示；上述茶树基因组中特异的SSR位点两侧保守序列如SEQIDNO:2所示；保守序列左侧序列如SEQIDNO:3所示。进一步，根据SSR引物设计原则所设计的引物序列为：上游：5'TGGGTTTCTTAGAGGGGATA3'Tm：54.1℃下游：5'TGGAGACAATGGAGGTAATG3'Tm：52.8℃。再进一步，所述引物的筛选步骤如下：茶树总DNA的提取，根据茶树全基因组序列进行SSR位点的选择和引物的设计筛选，PCR扩增和FragmentAnalyzerTM全自动毛细管电泳系统初筛，根据电泳结果筛选出核心引物。再进一步，所述茶树总DNA提取是用改良的CTAB方法对原产地采的鲜叶为材料进行提取。所述茶树全基因组序列进行SSR位点的选择和引物设计筛选，具体是在获得10万个含有SSR位点的序列中，六碱基是茶树基因组中较丰富且多态性较高的微卫星类型。因此根据如下原则选取3000条含有SSR位点的序列，成功的设计了450对引物，其中SSR引物筛选的原则如下：①引物的长度为18-23bp，目的片段在250bp-380bp左右。②GC含量为45％-55％，引物序列中避免出现三个或者四个连续碱基，③退火温度在45℃-58℃，最好在50℃左右，上下游引物Tm值相差不大于4℃④引物3’端避免出现3个以上连续碱基，尽量避免引物二聚体和发夹结构再进一步，PCR扩增和毛细管电泳初筛，具体是将PCR产物吸取2微升通过FragmentAnalyzerTM全自动毛细管电泳系统进行初筛，通过与目的片段比对进行引物的初筛，选取扩增率高、条带亮，峰型好的PCR产物通过FragmentAnalyzerTM全自动毛细管电泳系统进行复筛，能够精确的反映等位位点间的差异，筛选出多态性高的引物。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：1)本专利技术所开发的引物是建立在茶树基因组上，与EST-SSR相比，具有多态性高、数量多的特点。也通过大量的引物筛选，最终确定一对核心引物用于对品种的鉴定。2)本专利技术采用的是SSR指纹图谱技术，该技术是近年来随着分子生物学发展而发展起来的一种应用性遗传种质分析方法，具有稳定性好、操作简单，准确率高的特点，对不同茶树优良品种鉴定提供了一个精确、快速、简单的方法。。3)本专利技术所选用的材料不受季节、环境和测试时间的限制，可以对品种生长任何时期内的任意器官、或者制作好储存一段时间的干茶进行DNA提取，都不影响其鉴定结果。4)本专利技术在引物筛选所选用的是FragmentAnalyzerTM全自动毛细管电泳系统，该系统具有高通量、安全方便、灵敏度高等特点，对构建一套快速、精确的SSR指纹图谱技术起到很大的作用，并缩短了对柿大茶优良品种鉴定的周期。附图说明图1提取的四种柿大茶干茶以及鲜叶DNA琼脂糖凝胶电泳图；图2引物对四个茶树品种的PCR产物FragmentAnalyzerTM全自动毛细管电泳凝胶图；图3引物三次重复四种柿大茶毛细管电泳指纹图谱，其中，图3A是柿大茶1号，图3B柿大茶2号，图3C柿大茶6号,图3D柿大茶黄种。具体实施方式下面结合附图和具体实施方案对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。实施例1茶鲜叶总DNA的提取(1)选用的茶树品种：柿大茶1号；柿大茶2号；柿大茶6号；柿大茶黄种。由安徽农业大学郭河现代农业示范区产学研基地提供(2)以所选用茶树品种为材料，采用CTAB法提取总DNA，具体操作过程是：①取2ml离心管加磨碎的干茶粉末0.1g，加900mLCTAB提取液(提前预热至65℃)，加20mLβ-巯基乙醇，65℃水浴20min，每隔10min轻轻上下摇匀几次，然后加10mLRNAase放在65℃水浴15min，每隔5min上下摇匀几次。②13000r/min，离心10min,取上清液800mL,加400mLTris平衡酚，加等体积(800mL)的氯仿：异戊醇至2mL，上下颠倒混匀，13000r/min，离心10min，取上清液650mL到新的2ml管中，加氯仿：异戊醇650mL，颠倒混匀，13000r/min，离心5min，取上清液500mL置于新的2ml管中。③加乙醇(无水乙醇且要放置于-20℃冰箱中，用完及时放入冰箱中)至2ml处，上下颠倒几次(会有絮状物出现)放在-20℃冰箱中静置5min(时间可以放长些)，倒掉管中的乙醇，再加入乙醇至2ml处，轻轻上下混匀几次后倒掉乙醇(倒乙醇时不要把DNA倒掉)，然后8000r/min，30s，倒掉剩余的乙醇。④加500mLddH2O,放在37℃水浴溶解DNA，大概4min，放冰上预冷5min，加冷乙醇至2mL，轻轻上下颠倒混匀。离心3min，13000r/min，空柱离心2min，8000r/min，如果看到沉淀物不是透明色重复步骤4。⑤将空管放在真空泵抽提15min，看固体剩余量加200mlddH2o，测定其核酸含量，并用0.8％琼脂糖电泳。实施例2SSR位点的选择和引物的初筛在获得10万个含有SSR位点的序列中，以六核苷酸为重复单元的SSR位点较多且多态性较高。因此根据如下原则选取4000条含有SSR位点的序列，成功的设计了450对引物(由通用生物合成)，其中SSR引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用SSR指纹图谱鉴别柿大茶品种的方法，其特征在于，涉及茶树基因组中一个特异的微卫星SSR位点，该位点的重复单元是由六碱基组成，其变异程度在茶树基因组中最高，特异位点SSR位点序列如SEQ ID NO:1所示；上述茶树基因组中特异的SSR位点两侧保守序列如SEQ ID NO:2所示；保守序列左侧序列如SEQ ID NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.一种利用SSR指纹图谱鉴别柿大茶品种的方法，其特征在于，涉及茶树基因组中一个特异的微卫星SSR位点，该位点的重复单元是由六碱基组成，其变异程度在茶树基因组中最高，特异位点SSR位点序列如SEQIDNO:1所示；上述茶树基因组中特异的SSR位点两侧保守序列如SEQIDNO:2所示；保守序列左侧序列如SEQIDNO:3所示。2.根据权利要求1所述的利用SSR指纹图谱鉴别柿大茶品种的方法，其特征在于根据SSR引物设计原则所设计的引物序列为：上游：5'TGGGTTTCTTAGAGGGGATA3'Tm：54.1℃下游：5'TGGAGACAATGGAGGTAATG3'Tm：52.8℃。3.根据权利要求2所述的利用SSR指纹图谱鉴别柿大茶品种的方法，其特征在于所述引物的筛选步骤如下：茶树总DNA的提取，根据茶树全基因组序列进行SSR位...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦朝领，安焱林，刘升锐，郭凌霄，密孝增，程道杰，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34