CYP2D6*10基因多态性检测体系及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种CYP2D6*10基因多态性检测体系及其试剂盒，试剂盒包括PCR检测液和SYBR GreenI混合液；PCR检测液包括用于检测CYP2D6*10基因位点的上下游引物和肽核酸；肽核酸的核苷酸序列与CYP2D6*1野生型基因位点完全互补。本发明专利技术的CYP2D6*10基因多态性检测体系及其试剂盒灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行CYP2D6*10基因多态性检测。

【技术实现步骤摘要】
CYP2D6*10基因多态性检测体系及其试剂盒
本专利技术涉及一种检测CYP2D6*10基因多态性的方法和检测产品，属于生物

技术介绍
异喹胍4’-羟化酶(CYP2D6)是细胞色素P450超家族(cytochromeP450s,CYP)的第二亚家族中的重要成员。人群中CYP2D6的活性呈现强代谢者(EM)、中间代谢者(IM)、弱代谢者(PM)和超强代谢者(UM)四态分布的现象。目前已发现CYP2D6有100多种突变基因，它的突变类型决定酶代谢活性。CYP2D6基因多态性决定了药物代谢强度的差异，并影响临床用药品种和剂量的选择。CYP2D6除参与代谢一些内源性物质和某些环境中毒性化合物外，还参与20-30％的临床常用药物的代谢，包括β受体阻滞剂、多种抗心律失常药、抗高血压药、抗抑郁、抗精神病药、镇痛药、镇咳药等。中国人群中CYP2D6最常见的导致酶活性降低的等位基因为CYP2D6*10，与野生型CYP2D6*1相比，其外显子1上发生100C>T的点突变，引起该酶第34位脯氨酸(P)被丝氨酸(S)所替代所致，导致IM表型。目前主要采用一代测序、FLP、等位基因特异的寡核苷酸杂交、等位基因特异的PCR和基因芯片等技术，但是操作过程繁琐，需要更换反应管而易发生污染，多需要电泳和多步后处理，影响检测结果的准确性。或仪器设备昂贵，难以大规模推广应用。因此，开发一种检测CYP2D6*10基因多态性的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、更方便快捷的CYP2D6*10基因多态性检测是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行CYP2D6*10基因多态性检测的CYP2D6*10基因多态性检测体系及其试剂盒。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种CYP2D6*10基因多态性检测体系，包括用于检测CYP2D6*10基因位点的上下游引物，荧光染料SYBRGreenI，以及肽核酸；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述肽核酸的核苷酸序列与CYP2D6*1野生型基因位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。上述上下游引物进行了LNA修饰。上述上下游引物在反应体系中的最终浓度为0.1～0.3μM/L。上述上游引物在反应体系中的最终浓度为0.17μM/L，所述下游引物在反应体系中的最终浓度为0.25μM/L。上述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1～1.5μM/L。上述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1.25μM/L。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述检测体系的CYP2D6*10基因多态性检测产品。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种CYP2D6*10基因多态性检测试剂盒，包括PCR检测液和SYBRGreenI混合液；所述PCR检测液包括用于检测CYP2D6*10基因位点的上游引物、下游引物和肽核酸；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述肽核酸的核苷酸序列与CYP2D6*1野生型基因位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。上述上下游引物进行了LNA修饰；所述上下游引物在反应体系中的最终浓度为0.1～0.3μM/L；所述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1～1.5μM/L。上述CYP2D6*10基因多态性检测试剂盒还包括阳性对照A、阳性对照B和阴性对照；所述阳性对照液A是浓度为100ng/μL的包含CYP2D6*1基因位点的野生型质粒溶液；所述阳性对照液B是浓度为100ng/μL的包含CYP2D6*10基因位点的突变型质粒溶液；所述阴性对照液是不含CYP2D6基因的基因组DNA溶液。本专利技术具有积极的效果：(1)本专利技术采用PNA钳制实时定量PCR检测法，仅需1对引物和1条PNA，通过熔解曲线分析，即可将CYP2D6*10基因突变型与野生型区分开。通过一步反应，可解决PCR扩增、突变富集及定量整个过程，无需诸如电泳、杂交、酶切等后续步骤，大大简化了实验过程，整个反应过程在密封管内完成，最大限度地减少了污染的可能，降低假阳性率。(2)本专利技术的CYP2D6*10基因多态性检测方法及其试剂盒，仅需一对引物和一条肽核酸便可同时检测CYP2D6*10纯合子突变和杂合子突变，灵敏度高。灵敏度可达到0.1％～0.5％，与常规PCR的浓度相比，本专利技术容易地检测出非常低浓度样本的CYP2D6*10位点的基因型，克服了TaqMan探针法需要使用特异性探针进行检测的缺点，满足大样本量临床筛查的要求。(3)本专利技术选择SYBRGreenI作为荧光染料，价格低廉，大大降低检测成本。附图说明图1是采用实施例的试剂盒检测阳性对照A的野生型CYP2D6*1基因位点特异性产物峰Tm值。图2是采用实施例的试剂盒检测阳性对照B的突变型CYP2D6*10基因位点特异性产物峰Tm值。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
技术实现思路
对本专利技术作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术中。一、试剂盒的组成。本实施例的CYP2D6*10基因多态性检测试剂盒，包括PCR检测液、SYBRGreenI混合液、阴性对照、阳性对照A和阳性对照B。试剂盒各成分如表1所示。表1试剂盒成分表成分分装组成PCR检测液1管CYP2D6*10位点引物、肽核酸SYBRGreenI混合液1管——阳性对照A1管含野生型CYP2D6*1基因位点的质粒阳性对照B1管含突变型CYP2D6*10基因位点的质粒阴性对照1管不含CYP2D6*10基因的基因组DNA溶液上述表1中试剂盒组分的说明如下：1)SYBRGreenI混合液的主要成分包括DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、SYBRGreenI、缓冲液等(由Bioer公司提供，货号：B255l1)。2)PCR检测液包括:用于检测CYP2D6*10基因位点的上下游引物和与野生型CYP2D6*1位点完全互补的肽核酸。本实施例对上下游引物进行了LNA修饰。即在寡核苷酸链中引入一个LNA碱基，并通过调整LNA碱基在引物中的位置来调节最佳熔点(Tm)和杂交的特异性。经过修饰后的引物具有更高的Tm值，能够更好与突变模板结合，修饰后的实时定量PCR引物，长度较短，可以增加设计的灵活性。本实施例在PCR检测液中加入少量肽核酸(PNA)，不足以完全抑制野生型基因扩增，此时野生型的Tm值无变化，扩增效率较未加入PNA时明显降低，而对突变型基因扩增无影响，但其Tm下降明显，二者的Tm差值增大，此时可通过溶解曲线分析将两种类型本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CYP2D6*10基因多态性检测体系，其特征在于：包括用于检测CYP2D6*10基因位点的上下游引物，荧光染料SYBR Green

【技术特征摘要】
1.一种CYP2D6*10基因多态性检测体系，其特征在于：包括用于检测CYP2D6*10基因位点的上下游引物，荧光染料SYBRGreen，以及肽核酸；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述肽核酸的核苷酸序列与CYP2D6*1野生型基因位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。2.根据权利要求1所述的CYP2D6*10基因多态性检测体系，其特征在于：所述上下游引物进行了LNA修饰。3.根据权利要求1所述的CYP2D6*10基因多态性检测体系，其特征在于：所述上下游引物在反应体系中的最终浓度为0.1～0.3μM/L。4.根据权利要求3所述的CYP2D6*10基因多态性检测体系，其特征在于：所述上游引物在反应体系中的最终浓度为0.17μM/L，所述下游引物在反应体系中的最终浓度为0.25μM/L。5.根据权利要求1所述的CYP2D6*10基因多态性检测体系，其特征在于：所述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1～1.5μM/L。6.根据权利要求5所述的CYP2D6*10基因多态性检测体系，其特征在于：所述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1.25μM/L。7.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明，赵国玲，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31