精子piRNA和精子蛋白MitoPLD作为检测和预测男性不育的生物标志物制造技术

本发明专利技术公开了精子piRNA和精子蛋白MitoPLD作为检测和预测男性不育的生物标志物。所述标志物包括piRNA 10个(主要是piR‑1207和piR‑2107)和MitoPLD蛋白，该piRNA组合及MitoPLD蛋白可用精子活力的检测和预测；在本发明专利技术中，精子较易获得，无需其它组织，属于无创性检查；精子piRNA和MitoPLD蛋白可在分子水平上反映整个生精过程中的病理和生理状况，以其作为辅助检测指标可以提高检测的准确水平，并为男性生殖功能障碍的治疗提供了潜在靶点。

Sperm piRNA and sperm protein MitoPLD as a biomarker for the detection and prediction of male infertility

【技术实现步骤摘要】
精子piRNA和精子蛋白MitoPLD作为检测和预测男性不育的生物标志物
本专利技术属于生物
，涉及精子piRNA和精子蛋白MitoPLD作为检测和预测男性不育的生物标志物。
技术介绍
不孕不育已成为世界范围内的生殖健康难题。目前在全世界已有超过15％的夫妇受到不孕不育问题困扰(1,2)。其中约有20％～30％的不孕症是单由男性因素导致，50％的不孕症与男性因素有关，而最近几年该数据呈上升趋势(2,3)，所以男性在不孕不育中扮演了重要的角色，然而现在对造成男性不育的分子机制尚不完全清晰(4,5)。目前临床生殖实验室检查项目一般包括对精液的生化检查，酸性磷酸酶、乳酸脱氢酶-X等酶类检查以及精液免疫学检查，但这些技术都存在一些缺陷，不能直接反映睾丸的生精功能和全面评价精液质量，尤其是对在男性生殖中起到至关重要作用的精子的活力这一指标，缺乏可靠检测手段，并且现有方法也难以系统性地阐释造成精子活力缺陷的分子生物学机制，所以迫切需要寻找到一种更精确的方法来评价精子活力。在2006年几个实验组几乎同时在动物生殖细胞中发现了一类新型小分子非编码RNA，因为它们特异性地与PIWI蛋白质相互作用，所以被命名为PIWI相互作用RNA(PIWI-interactingRNA)，简称piRNA(6-9)。piRNA特异性地在生殖细胞中表达，在精子的形成过程中发挥了重要的作用，piRNA生成途径中的重要蛋白质也与配子形成或胚胎发育直接相关(10-12)。研究表明，piRNA及PIWI蛋白失活突变后，常常会导致该个体不育(10,13-15)。另外一个与初级piRNA形成相关的蛋白是单链特异性核酸内切酶Zuc(Zucchini或MitoPLD)(16-18)，该蛋白突变可造成逆转座子的去甲基化、去抑制及初级piRNA产生障碍，最终导致生殖障碍。我们通过对精子中的RNA进行二代高通量测序，结果显示有大量的piRNA存在于精子中。通过对这些piRNA进行研究，有望发现一些与男性生殖功能(如精子活力等)密切相关的piRNA，其有望成为检测和预测男性不育的生物标志物。同时，我们对piRNA形成过程相关蛋白(如MitoPLD)进行研究，有望发现与男性生殖功能(如精子活力等)密切相关的蛋白，进而应用于男性生殖功能障碍的临床诊断、预测和筛查。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过筛查与男性精子活力密切相关的piRNA的特异性变化及piRNA生成相关蛋白的变化(如MitoPLD)，筛选出因精子活力低导致的男性不育人群和正常健康生育人群中表达差异显著的精子piRNA及piRNA生成相关蛋白(如MitoPLD)，通过检测这些piRNA和piRNA生成蛋白(如MitoPLD)，为诊断男性精子活力提供新指标和方法。目前，本专利技术已发现精子中能够检测到高浓度的piRNA，并且发现特异性的piRNA组合与精子活力密切相关，能作为男性因精子活力低导致生殖功能障碍的分子标志物，具有很高的特异性和灵敏性。同时本专利技术发现MitoPLD蛋白在活力低下的精子中表达量下降，也能作为男性因精子活力低导致生殖功能障碍的分子标志物。精子piRNA和MitoPLD蛋白作为新的生物标志物，在检测男性精子活力方面具有重要的指导意义，能显示出分子水平的遗传信息，有助于揭示男性精子活力降低的分子机制。本专利技术的上述目的是采用以下技术方案来实现的：与男性生殖功能障碍相关的生物标志物，包含MitoPLD蛋白，该蛋白在NCBI数据库中的登录号为NM_178836.3；所述的男性生殖功能障碍为弱精症。与男性生殖功能障碍相关的生物标志物还优选包括下列piRNA中的任意一种或多种：piR-hsa-28131、piR-hsa-1207、piR-hsa-23317、piR-hsa-27493、piR-hsa-2107、piR-hsa-25783、piR-hsa-2106、piR-hsa-25781、piR-hsa-18709、piR-hsa-25780。piRNA对应的核苷酸序列piR-hsa-28131GGCAUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGC(SEQIDNO.1)piR-hsa-1207AGCAUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGC(SEQIDNO.2)piR-hsa-23317CCGCCUGGGAAUACCGGGUGCUGUAGGCUUA(SEQIDNO.3)piR-hsa-27493GCAUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCAC(SEQIDNO.4)piR-hsa-2107AUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCUG(SEQIDNO.5)piR-hsa-25783UUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCUGCC(SEQIDNO.6)piR-hsa-2106AUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCC(SEQIDNO.7)piR-hsa-25781UUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCUG(SEQIDNO.8)piR-hsa-18709UGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCUG(SEQIDNO.9)piR-hsa-25780UUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCU(SEQIDNO.10)与男性生殖功能障碍相关的生物标志物进一步优选包括MitoPLD蛋白及piR-hsa-1207和piR-hsa-2107。一种用于检测和预测男性生殖功能障碍的试剂盒，包含Westernblot法和ELISA法检测精子MitoPLD蛋白的试剂。本专利技术所述的试剂盒，还优选包含使用TaqMan探针Real-timePCR法检测piR-hsa-1207和piR-hsa-2107的探针和引物。本专利技术所述的生物标志物在制备以精子为检测对象用于诊断和/或预测男性生殖功能障碍的检测试剂中的应用。Westernblot法和ELISA法检测精子MitoPLD蛋白的试剂在制备以精子为检测对象用于诊断和/或预测男性生殖功能障碍的检测试剂中的应用。Westernblot法和ELISA法检测精子MitoPLD蛋白的试剂以及检测piR-hsa-1207和piR-hsa-2107的TaqMan探针和引物在制备以精子为检测对象用于诊断和/或预测男性生殖功能障碍的检测试剂中的应用。上述piRNA组合的筛选方法包括以下步骤：(1)收集精子样本，包括精子活力正常生育男性以及精子活力弱的生殖功能障碍男性的精子样本，并提取总RNA；(2)采用高灵敏度、精确性和高重复性的高通量二代测序技术(high-throughputsequencingtechnology)，对上述RNA进行检测，初步筛选出精子活力低下与正常生育男性精子中表达差异显著的一组piRNA(精子含量高且差异显著的前10个piRNA，筛选标准为精子中含量最高的前10个piRNA并且在弱精症中相对正常对照降低1.5倍以上)；(3)进一步使用实时荧光定量PCR方法验证(最终确定piR-hsa-1207和piR-hsa-2107为最优化组合)。具体来说，上述筛选方法包括以下步骤：(1)分别收集正常生育男性及精子活力弱的生殖功能障碍男性的精子，并提取总RN本文档来自技高网...

【技术保护点】
与男性生殖功能障碍相关的生物标志物，其特征在于包含MitoPLD蛋白，该蛋白在NCBI数据库中的登录号为NM_178836.3，所述的男性生殖功能障碍为弱精症。

【技术特征摘要】
1.与男性生殖功能障碍相关的生物标志物，其特征在于包含MitoPLD蛋白，该蛋白在NCBI数据库中的登录号为NM_178836.3，所述的男性生殖功能障碍为弱精症。2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于还含有下列piRNA中的任意一种或多种：piR-hsa-28131、piR-hsa-1207、piR-hsa-23317、piR-hsa-27493、piR-hsa-2107、piR-hsa-25783、piR-hsa-2106、piR-hsa-25781、piR-hsa-18709、piR-hsa-25780。3.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于还含有piR-hsa-1207和piR-hsa-2107。4.一种用于检测和预测男性生殖功能障碍的试剂盒，其特征在于包含Western...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈熹，洪叶挺，付正，
申请(专利权)人：南京优智源医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32