一种可预测人冠状动脉粥样硬化性心脏病严重缺血风险的mRNA及其应用制造技术

一种可预测人冠状动脉粥样硬化性心脏病严重缺血风险的mRNA及其应用。该生物标志物序列如SEQ ID NO.1所示。该mRNA的表达水平既可以作为人冠脉粥样硬化导致的严重缺血性心脏病治疗靶点和依据，也可用于该疾病的治疗药物的筛选及效果评价；其引物可制备定量PCR试剂盒，用于该类疾病的临床辅助诊断。

MRNA and its application in predicting the risk of severe ischemic heart disease in human coronary heart disease

MRNA and its application to predict the risk of severe ischemic heart disease in human coronary heart disease. The biomarkers such as SEQ ID NO.1 sequence shown. The expression level of the mRNA can be used as one of coronary atherosclerosis causes severe ischemic heart disease therapeutic target and basis, can also be used to evaluate the screening of drugs to treat the disease and the effect of the preparation of primer; quantitative PCR kit for clinical auxiliary diagnosis the disease off.

【技术实现步骤摘要】
一种可预测人冠状动脉粥样硬化性心脏病严重缺血风险的mRNA及其应用
本专利技术属于冠心病的分子生物学诊断领域，涉及评估冠状动脉粥样硬化性心脏病严重缺血风险评估、预测及诊断相关的生物标志物及其临床应用。
技术介绍
在全球范围内，心血管疾病是威胁人类健康的头号杀手，其造成的死亡已超过肿瘤，在各类疾病造成的死因中跃居首位。在我国，心血管疾病导致的死亡约占总死亡原因的25％，且此比例呈逐年上升的趋势，给我国带来了巨大的经济与社会负担。冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronaryatheroscleroticheartdisease，CAD)，简称冠心病，是心脏病中最常见的一种；主要是由于冠状动脉出现动脉粥样硬化病变造成血管腔狭窄或者阻塞，引起心肌细胞缺血缺氧乃至坏死而导致。近年来的研究显示由循环血液中免疫细胞如单核细胞、淋巴细胞介导的慢性炎症反应是动脉粥样硬化及心血管疾病的基础；伴随着炎症反应，血液中单核细胞、淋巴细胞等免疫细胞调控其基因表达水平，而参与动脉粥样硬化发生、发展的进程。因此，寻找血液中免疫细胞基因表达标志物以作为有效诊断与干预靶点，将为该疾病的治疗带来希望。目前在临床上，如果行心脏冠脉造影发现冠脉单支或多支血管狭窄超过70％左右，可认为心肌有严重缺血风险，需植入支架以重建血运。鉴于CAD的高发病率和高死亡率，早期诊断，判断缺血风险，预测心肌坏死风险非常重要，尤其是可用于CAD的早期诊断和危险分层的有效标志物将具有重要价值。目前诊断冠心病的方法有很多，如影像学方法发射型计算机断层扫描仪(ECT)。ECT是一种利用放射性核素的检查方法，虽具敏感性高等优点，但费用高；而常规方法如心电图、超声检查等敏感性及特异性不高；目前CAD诊断的金标准是冠脉造影，但其费用较高且具有创伤性。在实验室诊断方面，虽然已有多种血液生化标志物如肌钙蛋白、肌球蛋白、肌酸激酶同工酶等用于CAD的诊断，但由于全身多种细胞可合成并分泌这些物质到血液中，使得这些生化指标的临床特异性和检测敏感性较低。尤其在判断缺血风险方面，对于冠心病患者何时或者何种程度缺血才需要血运重建，需要有创的冠脉造影加上血流储备评估技术(如FFR)等方法才能确定。然而目前，关于冠脉动脉粥样硬化性缺血心脏病，尚无可靠的血液学诊断标志物。因此，临床亟待一种简易、无创的方法评估冠心病患者的缺血程度，判断缺血风险，预测心肌缺血甚至坏死，评价药物疗效，并对远期预后做出预测特异性高的血液学标志物。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供一种可预测人冠状动脉粥样硬化性心脏病严重缺血风险的mRNA及其应用。技术方案：一种可预测人冠状动脉粥样硬化性心脏病严重缺血风险的mRNA，序列如SEQIDNO.1所示。上述mRNA在制备预测或诊断人冠状动脉粥样硬化性心脏病严重缺血风险试剂盒中的应用。上述试剂盒含有SEQIDNO.1所示序列。上述试剂盒含有SEQIDNO.1所示序列的引物对，所述引物对为：5’-CCAGCAAGCCCACTGCACCC-3’；5’-GGAAGTCCTCTGACTCTTGG-3’。上述mRNA在筛选针对人冠状动脉粥样硬化性心脏病改善心肌供血药物中的应用。预测或诊断人冠状动脉粥样硬化性心脏病严重缺血风险试剂盒，含有如SEQIDNO.1所示的mRNA。有益效果：本专利技术提供一种与冠脉粥样硬化相关的mRNA生物标志物，该标志物可作为人冠脉粥样硬化导致的严重缺血性心脏病治疗靶点，也可用于评价该疾病的治疗药物的疗效；其检测引物可制备成试剂盒，并用于该疾病的临床辅助诊断。附图说明图1：SEQIDNO.1所示生物标志物的扩增曲线图；图2：GAPDH扩增曲线图；图3：SEQIDNO.1所示生物标志物的熔解曲线图；图4：GAPDH熔解曲线图；图5：SEQIDNO.1所示生物标志物的PCR产物凝胶电泳图；图6：检测经冠脉造影确认冠脉狭窄程度≥70％、有严重缺血指征的患者(阳性组)和无冠状动脉粥样硬化或冠脉狭窄程度<70％、无严重缺血指征患者(阴性组)SEQIDNO.1所示生物标志物的相对表达量示意图。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步的阐述。本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本专利技术的包含范围不限于下述的实施例。下面的实施例中未注明的条件和方法等均按照常规或者制造厂商所建议的条件进行。实施例1试剂盒组成：1、人外周血淋巴细胞分离液(天津灏洋生物，货号：LST1077)2、SEQIDNO.1所示生物标志物的引物，采用Primer5软件设计特异性引物，由Invitrogen(上海)公司(http://www.thermofisher.com)合成。3、RNA提取试剂盒InvitrogenTMTRIzolReagent(美国Invitrogen公司,货号：15596018)4、逆转录试剂PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(大连宝生物TAKARA公司,货号R047)5、FastStartUniversalSYBRGreenMaster(美国Roche公司，货号：04913914001)6、琼脂糖(西班牙BIOWEST公司,货号：111860)7、核酸染料Gel-Red(碧云天，货号D0139)8、6×DNA上样缓冲液(碧云天，货号D0071)实验步骤：1、有胸部不适症状的患者经冠脉造影确诊，分为两组：1)冠脉粥样硬化导致≥70％冠脉狭窄，即有支架置入实现心肌血运重建指征的患者(阳性组)；2)冠脉无硬化斑块或有动脉粥样硬化斑块但狭窄程度<70％的患者(阴性组)。取患者10mL外周血，按照天津灏洋生物人外周血淋巴细胞分离液分离步骤提取外周血单个核细胞(PBMC)；2、按照InvitrogenTMTRIzolReagent操作指南提取PBMC总RNA；3、检测A260/A280比值，分析总RNA纯度；4、按照TAKARA反转录试剂盒说明，第一步进行去除基因组DNA反应；42℃温育2分钟(或者室温温育5分钟)，备用。5、按照TAKARA反转录试剂盒说明进行反转录成cDNA，加入以下各组分至EP管中；PCR仪器上37℃温育15分钟。再85℃加热5分钟，最后，4℃放置备用。6、实时荧光定量PCR：采用Roche480IIPCR仪进行扩增，内参选用GAPDH，序列为5’-GGATTTGGTCGTATTGGG-3’(forward)，5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’(reverse)。qPCR反应体系配制qPCR反应程序设置7、计算相对表达率设定CtA为样本SEQIDNO.1所示生物标志物的Ct值，CtB为样本内参GAPDHCt值，ΔCt＝CtA-CtB。取阴性组ΔCt的平均值MΔCt(阴性组)。根据2-ΔΔCt公式计算两组样品目标基因相对表达情况：ΔΔCt＝ΔCt(阳性组)-MΔCt(阴性组)＝X，则阳性组样本SEQIDNO.1所示生物标志物的表达水平为阴性组的2-X倍。取平均值，以非配对t检验评价统计学意义。8、采用DNA琼脂糖凝胶电泳检测产物特异性1)安装电泳槽：将BioRad电泳仪的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可预测人冠状动脉粥样硬化性心脏病严重缺血风险的mRNA，其特征在于序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种可预测人冠状动脉粥样硬化性心脏病严重缺血风险的mRNA，其特征在于序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述mRNA在制备预测或诊断人冠状动脉粥样硬化性心脏病严重缺血风险试剂盒中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述试剂盒含有SEQIDNO.1所示序列。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述试剂盒含有SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙崇秀，肖平喜，陈小林，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32