一种通过piR-30229对弱精症诊断试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种弱精症标记物及其检测方法、试剂盒。本发明专利技术所提供的弱精症标记物包括受试者精浆中稳定存在且可检测的与Piwi蛋白相作用的核糖核酸piR-30229。本发明专利技术还提供了包括检测该弱精症标记物的工具或元件的试剂盒。本发明专利技术所提供的组合、方法、试剂盒能够用于辅助弱精症的诊断与鉴别诊断、疾病并发症的发生和复发的预测、疗效评价，以及药物活性成分的筛选、药效评价等方面，具有灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于弱精症普查等相关工作，成为早期诊断弱精症的有效手段。弱精症的有效手段。弱精症的有效手段。

【技术实现步骤摘要】
一种通过piR-30229对弱精症诊断试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于医疗诊断领域，涉及人精浆中piRNA分子的分离、定性和定量分析。更具体地，本专利技术是一种检测弱精症病人精浆中piR-30229的方法，通过弱精症病人精浆中piR-30229的变化，体外诊断弱精症。

技术介绍

[0002]近年来，由于受到各种因素的影响，导致不育症患者在不断增加，不育症会给患者的身心与生活质量造成严重影响，给家庭带来沉重负担。随着人们生活压力不断增加，环境污染、生活与饮食方式等发生较大改变，这些因素均与不育症的发生有着密切联系。
[0003]在不育症患者中，大多数为少弱精症患者，其精子活性较低，更甚者无活动能力。在男性中，少精弱精症是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一。弱精症的原因比较多，是否造成不育，要看弱精症的程度。
[0004]如果是轻度的弱精症一般对生育没有大的影响，如果是严重的弱精症要做进一步的检查，看看引起弱精症的原因，有没有前列腺炎导致的弱精症，有没有免疫因素导致的弱精症，查明弱精症的原因后针对病因治疗弱精症。目前，主要依靠常规精液分析进行诊断，常规精液分析是判断男性生育能力及诊断弱精症的临床指标，但具有步骤复杂，样本不易存放等缺点。寻找灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放的诊断技术非常重要。
[0005]小分子非编码RNA(small non-coding RNA)，主要包括tRNA、snRNA、snoRNA、microRNA(miRNA)、siRNA和Piwi-interacting RNA(piRNA)等非编码蛋白质的RNA分子。随着对RNA研究的深入，已知小分子非编码RNA在基因的转录、转录后调控以及引导染色质修饰复合物中起到了重要的作用。piRNA是从哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类长度约26～31nt的小分子非编码RNA，并且与PIWI蛋白家族成员相结合，在精子形成中起着重要的作用，可以作为不孕不育症的潜在药物靶点和诊断标记物。

技术实现思路

[0006]精液作为男性生殖系统的主要代谢产物，可以反映出整个生殖系统的生理病理状况，其检测结果对男性生殖健康具有指导意义。已知，精浆中稳定存在多种piRNA，在精子形成中发挥重要作用。
[0007]为寻找弱精症标记物并对其进行准确检测，本专利技术人基于已有的研究
[0008](1)研究弱精症患者的精浆中的piRNA的特异性变化；
[0009](2)通过用于检测精浆中piRNA的生物芯片测定弱精症精浆中piRNA的变化；
[0010](3)将筛选到的在弱精症及正常生理状态下表达差异较大的piR-30229应用于精浆piRNA检测技术，制备应用于弱精症诊断等领域的诊断试剂盒。
[0011]通过上述对精浆中piRNA与弱精症的相关性研究，申请人提出了以精浆中piR-30229作为弱精症检测标记物，建立一种体外检测精浆中稳定存在的特定piRNA的方法，通过检测piR-30229的特异性变化来进行弱精症的早期诊断，同时可以进一步进行药性判断，
real-time PCR结果。
[0033]具体实施方法
[0034]以下参照具体的实例来说明本专利技术。本领域技术人员能够理解，这些实例仅用于说明本专利技术，其不以任何方式限制本专利技术的范围。
[0035]精浆中piRNA的定量检测实验，具体步骤为：
[0036](1)收集正常人及某些病人的精浆
[0037](2)使用Trizol试剂先提取100μl精浆的总RNA。
[0038](3)RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括：1μl AMV、2μl dNTP、4μl AMV bufer、5μl RRI、1μl 特异性引物、9.5μl DEPC、2μl RNA。反应步骤为16℃反应15分钟，42℃反应60分钟，85℃反应5分钟，4℃保存。
[0039](4)进行Quantitative real-time PCR反应。反应体系为：0.3μl rTaq、0.4μl DNTP、1.2μl Mg2+、2μl 10
×
buffer、14.5μl ddH2O、0.4μl特异性引物、0.3μl特异性探针、1μl cDNA。反应步骤：95℃反应5分钟一个循环；95℃反应15秒，60℃反应1分钟，40个循环。
[0040](5)数据处理方法为ΔΔCT法，CT设为反应达到阈值时的循环数，则piR-30229相对内参的表达量可以用方程2^ΔCT表示，其中ΔCT＝CT样品-CT内参。
[0041]如图所示，piR-30229在弱精症病人中表达显著降低，说明其可以作为一种新的弱精症诊断标记物。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种弱精症标记物，其特征在于，所述标记物包括在人体精浆中稳定存在且可检测的与Piwi蛋白相作用的核糖核酸成熟体PiR-30229，该序列由下列核苷酸组成：AAGCCAGGGATTGTGGGTTCGGGTCCCATCT。2.一种通过PiR-30229对弱精症诊断试剂盒，其特征在于，所述的PiR-30229片段逆转录试剂包括：引物：5
’--
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGATGG
--3’
。3.一种通过PiR-30229对弱精症诊断试剂盒，其特征在于，所述的PiR-30229片段扩增试剂包括：正向引物：5
...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱卿，陈骁锐，赵艺，夏玉贵，屠盛，林巧芳，赵然然，
申请(专利权)人：南京优智源医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：