一种多重荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术实施例涉及一种多重荧光定量PCR试剂盒。其特征在于：包括：第一反应体系试剂、第二反应体系试剂和第三反应体系试剂，第一反应体系试剂至第三反应体系试剂中包括：扩增引物和探针序列。本发明专利技术实施例中使用了多种探针的组合形式进行多重荧光定量PCR，在不影响检测结果的同时，减少了PCR反应的次数。减少了PCR反应的次数。

【技术实现步骤摘要】
一种多重荧光定量PCR试剂盒


[0001]本专利技术涉及检测分析领域，尤其涉及一种多重荧光定量PCR试剂盒。

技术介绍

[0002]角膜营养不良是临床上一系列与家族遗传有关的原发性、进行性及致盲性角膜病变的总称，其发病率约为1/1000。由TGFBI基因R124C突变引起的颗粒状营养不良I型、由TGFBI基因R124H突变引起的颗粒状营养不良II型、由TGFBI基因R124L突变引起的Reis-B
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cklers角膜营养不良、由TGFBI基因R555W突变引起的颗粒状营养不良I型、由TGFBI基因R555Q突变引起的Thiel-Behnke角膜营养不良均是我国人群中最为常见的角膜营养不良。但这5种基因突变引起的角膜营养不良患者在接受治疗性屈光手术时，部分存在较大的不良反应，国内外先后报道了多例由LASIK术后引起这些角膜营养不良患者的角膜混浊加剧、矫正视力明显下降的病历。因此通过基因检测技术来筛查这类人群能为医生决策治疗手段提供参考。
[0003]现有技术方案中，可以针对上述任意一个突变位点设计特异性荧光探针及一对扩增引物，再找一个内参基因一般是GAPDH，通过野生型探针的Ct值和突变型探针Ct值的差值，判断基因型。但这种方案中，一次只能检测一个突变位点，并且不是所有突变位点的探针都能混在一起做多重反应，有些突变位点即使探针距离很远，但也会相互影响。
[0004]现有技术方案中，还可以针对一个突变位点设计特异性突变阻滞扩增系统(ARMS)引物，结合通用型荧光探针，再找一个内参基因一般是GAPDH，根据特异性引物扩增产物探针检测的Ct值与内参检测的Ct值差值进行基因型判断。对于此种方法可以做成多重反应，但多重反应受位点影响较大，对于同一SNP位点的多种突变、相邻SNP位点的检测不能在同一反应中进行检测。本专利技术涉及的R124H、R124L为同一SNP位点突变，R124C与R124H、R124L为相邻SNP位点突变；R555W与R555Q也为相邻SNP位点突变，不适合该种方法。
[0005]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0006]专利技术目的
[0007]本专利技术的目的在于提供一种多重荧光定量PCR试剂盒，其包括：第一反应体系试剂、第二反应体系试剂和第三反应体系试剂，其中：
[0008]所述第一反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.2所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.3所示序列的探针、SEQ ID NO.4所示序列的探针和SEQ ID NO.5所示序列的探针；
[0009]所述第二反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.7所示序列的扩增引物、如SEQ ID NO.8所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.9所示序列的探针、SEQ ID NO.10所示序列的探针和SEQ ID NO.11所示序列的探针；
[0010]所述第三反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.2所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.3所示序列的探针和SEQ ID NO.6所示序列的探针；
[0011]第一反应体系试剂至第三反应体系试剂中，各个探针序列的5
’
和3
’
端分别与荧光基团和淬灭基团相连，其中：同一反应体系试剂中的各个探针序列5
’
端的荧光基团各不相同，所述荧光基团选自：FAM、CY5或VIC。
[0012]上述多重荧光定量PCR试剂盒在一种可能的实现方式中，所述第三反应体系试剂中还包括：如SEQ ID NO.12所示序列的扩增引物、如SEQ ID NO.13所示序列的扩增引物和SEQ ID NO.14所示序列的探针。
[0013]上述多重荧光定量PCR试剂盒在一种可能的实现方式中，SEQ ID NO.14所示序列的探针的5
’
和3
’
端分别与荧光基团和淬灭基团相连，其中：荧光基团选自：FAM、CY5或VIC。
[0014]上述多重荧光定量PCR试剂盒在一种可能的实现方式中，各个探针序列的3
’
端包括MGB淬灭基团。
[0015]上述多重荧光定量PCR试剂盒在一种可能的实现方式中，多重荧光定量PCR试剂盒中还包括：用于荧光定量PCR的其他试剂。
[0016]上述多重荧光定量PCR试剂盒在一种可能的实现方式中，采用该多重荧光定量PCR试剂盒检测的方法包括以下步骤：1)提取样本中的DNA，将其作为DNA模板，DNA浓度不低于10ng/ul，DNA的OD260/OD280值在1.7～2.0之间；2)将DNA模板分别加入第一反应体系试剂、第二反应体系试剂、第三反应体系试剂中；3)进行荧光定量PCR扩增反应；4)判断是否发生突变。
[0017]上述多重荧光定量PCR试剂盒在一种可能的实现方式中，所述样本为血液样本或口腔上皮细胞样本。
[0018]上述多重荧光定量PCR试剂盒在一种可能的实现方式中，步骤3)中荧光定量PCR扩增的反应体系为总体积为20μl如下体系：
[0019][0020][0021][0022]上述多重荧光定量PCR试剂盒在一种可能的实现方式中，步骤3)中PCR扩增的反应条件如下：
[0023][0024]上述多重荧光定量PCR试剂盒在一种可能的实现方式中，步骤4)中判断是否发生突变的方法包括以下步骤：
[0025]针对反应体系1中的结果判断：
[0026]R124H探针ct值>35时，判断反应体系中没有R124H突变；R124L探针ct值>35时，判断反应体系中没有R124L突变；如果R124H探针ct值≤35或R124L探针ct值≤35，按照以下方法进行判断：
[0027](1)R124WT探针ct值-R124H探针ct值的差值＞4、R124L探针ct值-R124WT探针ct值＞5，则判断此样本为R124H纯合突变、R124L未突变样本；
[0028](2)0≤R124H探针ct值-R124WT探针ct值的差值≤3.5、R124L探针ct值-R124WT探针ct值的差值＞5，则判断此样本为R124H杂合突变、R124L未突变样本；
[0029](3)R124H探针ct值-R124WT探针ct值的差值＞5、R124L探针ct值-R124WT探针ct值的差值＞5，则判断此样本为R124H未突变、R124L未突变样本；
[0030](4)R124WT探针ct值-R124L探针ct值的差值＞4、R124H探针ct值-R124WT探针ct值的差值＞5，则判断此样本为R124L纯合突变、R124H未突变型样本；
[0031](5)0≤R124L探针ct值-R124WT探针ct值的差值≤3.5、R124H本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括：第一反应体系试剂、第二反应体系试剂和第三反应体系试剂，其中：所述第一反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.2所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.3所示序列的探针、SEQ ID NO.4所示序列的探针和SEQ ID NO.5所示序列的探针；所述第二反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.7所示序列的扩增引物、如SEQ ID NO.8所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.9所示序列的探针、SEQ ID NO.10所示序列的探针和SEQ ID NO.11所示序列的探针；所述第三反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.2所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.3所示序列的探针和SEQ ID NO.6所示序列的探针；第一反应体系试剂至第三反应体系试剂中，各个探针序列的5
’
和3
’
端分别与荧光基团和淬灭基团相连，其中：同一反应体系试剂中的各个探针序列5
’
端的荧光基团各不相同，所述荧光基团选自：FAM、CY5或VIC。2.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述第三反应体系试剂中还包括：如SEQ ID NO.12所示序列的扩增引物、如SEQ ID NO.13所示序列的扩增引物和SEQ ID NO.14所示序列的探针。3.根据权利要求2所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：SEQ ID NO.14所示序列的探针的5
’
和3
’
端分别与荧光基团和淬灭基团相连，其中：荧光基团选自：FAM、CY5或VIC。4.根据权利要求1或3所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：各个探针序列的3
’
端包括MGB淬灭基团。5.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：多重荧光定量PCR试剂盒中还包括：用于荧光定量PCR的其他试剂。6.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：采用该多重荧光定量PCR试剂盒检测的方法包括以下步骤：1)提取样本中的DNA，将其作为DNA模板，DNA浓度不低于10ng/ul，DNA的OD260/OD280值在1.7～2.0之间；2)将DNA模板分别加入第一反应体系试剂、第二反应体系试剂、第三反应体系试剂中；3)进行荧光定量PCR扩增反应；4)判断是否发生突变。7.根据权利要求6所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述样本为血液样本或口腔上皮细胞样本。8.根据权利要求6所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：步骤3)中荧光定量PCR扩增的反应体系为总体积为20μl如下体系：
9.根据权利要求6所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：步骤3)中PCR扩增的反应条件如下：
10.根据权利要求6所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：高贵丽，张天赋，
申请(专利权)人：北京中因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：