一种利用三维培养系统诱导人诱导性多能干细胞获得成熟肝细胞的方法技术方案

本发明专利技术提供一种利用三维培养系统高效、均质地将人诱导性多能干细胞诱导分化为肝细胞的方法，是利用聚乳酸‑羟基乙酸共聚物(PLGA)制成的三维立体细胞培养支架，和/或联合多种诱导因子包括定型内胚层诱导因子、肝细胞生长因子等诱导人诱导性多能干细胞分化为成熟的肝细胞。本发明专利技术建立了一种新的获得人成熟肝细胞的方法，首次使用三维立体培养系统和/或联合多种诱导因子高效诱导人诱导性多能干细胞分化为成熟的肝细胞，为人诱导性多能干细胞诱导分化为肝细胞提供技术支持，并为肝病机理性研究、药物筛选等领域的研究提高细胞材料。

A method of using a three-dimensional culture system to induce human induced pluripotent stem cells to obtain mature liver cells

The present invention provides a three-dimensional culture system, and the heterogeneity of human induced pluripotent stem cells differentiate into liver cells is the use of methods, poly lactic acid glycolic acid (PLGA) into three-dimensional cell culture support and / or the combination of various factors including induction of definitive endoderm inducing factor, hepatocyte growth factor induction of human induced pluripotent stem cells to differentiate into mature liver cells. The invention provides a new method to obtain mature liver cells, three-dimensional culture system for the first time and / or combined with a variety of inducer efficient induction of human induced pluripotent stem cells to differentiate into mature liver cells, pluripotent stem cells differentiate into hepatocytes and provide technical support for the people and improve the cell induction. Materials for the study of liver disease research, drug screening mechanism etc..

【技术实现步骤摘要】
一种利用三维培养系统诱导人诱导性多能干细胞获得成熟肝细胞的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种利用三维培养系统获得成熟肝细胞的方法。
技术介绍
肝功能衰竭严重威胁着人类健康，致死率高。肝移植治疗是目前最理想的治疗肝衰竭的手段，但由于供体的短缺，无法进行普遍推广。人工肝支持系统可以暂时替代肝脏功能，帮助病人度过肝衰竭危险期等待肝细胞再生，或维持病人生存至得到得到合适的供体进行肝移植。生物人工肝是目前被认为最理想的人工肝，但其发展受限于肝细胞来源的限制。人多能干细胞，包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞，可以在体外适当的培养条件下长期大量扩增，并具有分化为人体所需要的所有细胞类型包括造血干细胞的潜能，是一种解决成熟肝细胞来源问题的方法。IPS细胞研究的发展及其在细胞替代治疗中的临床应用前景为生物人工肝提供了强大的技术支持。2009年，Song等首次在发表的文献中报道通过先后加入ActivinA、成纤维细胞生长因子4(fibroblastgrowthfactor4,FGF4)和骨形成蛋白2(bonemorphogeneticprotein2,BMP2)等因子通过四个阶段从iPS细胞中诱导除了类似肝细胞样的细胞。Takata等2011年报道通过“两步法”首先加入高剂量的ActivinA培养3d，诱导iPS细胞向定型内胚层细胞转化，在得到内胚层细胞后在通过加入HGF，继续培养5d，通过两步法也能够获得肝细胞样细胞。2012年，Chen等报道应用“三步法”来诱导iPS细胞获得成熟肝细胞，第一步在iPS细胞培养基中加入ActivinA、Wnt3α和HGF；第二步，应用肝定型培养基进一步培养细胞；第三步，在IMDM培养基中，同时加入含有抑癌素蛋白M、地塞米松及通用型培养基，实现了体外将iPS细胞诱导为肝细胞样细胞，并且诱导效率明显提高。聚乳酸(polylacticacid,PLA)和聚羟基乙酸(polyglycolicacid,PGA)是最典型的合成可降解聚合物，也是结构最简单的线性聚羟基脂肪酸酯。它们作为第一批可降解吸收材料被美国FDA批准用于临床，是迄今研究最广泛、应用最多的可降解生物材料。PLGA的性能会由于PLA和PGA比例的不同而产生力学性能、降解速度及成纤维细胞的生物学反应的差异。而合适比例的PLGA可以作为细胞生长的支架，为细胞的生长提供可黏附的环境。在PLGA支架上联合诱导因子又可以增加诱导因子对细胞生长、分化、代谢的刺激作用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种利用三维培养系统获得成熟肝细胞的方法，通过以下技术方案实现：以机械传代法(玻璃拉针分割、挑取)人诱导性多能干细胞，根据试剂说明书对各种聚乳酸、聚乙醇酸材料等三维细胞培养材料进行处理，和/或联合相关肝向分化诱导因子(包括定型内胚层诱导因子-Wnt3α、激活素A，肝向内胚层诱导因子-骨形成蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子，肝祖细胞诱导因子-肝细胞生长因子，肝细胞成熟诱导因子-肝细胞生长因子)，经过15-30天的诱导和培养，形成成熟肝细胞的方法。成熟肝细胞是由人诱导性多能干细胞诱导分化获得的。所述的人诱导性多能干细胞是利用含有转录因子pMXs-OCT4、pMXs-SOX2、pMXs-KLF4和pMXs-c-MYC四种因子的逆转录病毒诱导人包皮成纤维细胞，重编程获得的人诱导性多能干细胞。所述细胞三维培养材料包括多种三维细胞培养基质或细胞培养支架，如包裹了不同诱导因子的聚乳酸、聚乙醇酸不同比例的PLGA微球或PLGA微球支架。在成熟肝细胞诱导期间在诱导培养基中辅助添加的诱导因子抑癌蛋白M、地塞米松和转铁蛋白，这几种诱导因子不与PLGA微球支架联合在一起，但是通过添加在培养基中的方式辅助促进肝细胞成熟。酶联免疫酶标法(Elisa)、PCR法、免疫荧光法检测成熟肝细胞诱导过程中白蛋白(ALB)、细胞角蛋白(CK-18、CK-19)等Marker的表达。本专利技术的特点是利用一种可生物降解的三维细胞培养系统，和/或联合多种诱导因子、肝细胞成熟因子等诱导多能干细胞分化为成熟肝细胞，建立了高效获得成熟肝细胞的方法。该方法为获得临床可用的肝细胞提供可靠的细胞来源，首次建立了利用三维培养系统和/多种因子等高效诱导多能干细胞分化为成熟肝细胞的系统，为获得临床可用的成熟肝细胞提供了理论基础和技术平台，并为多能干细胞来源的成熟肝细胞在疾病机理探索、药物筛选等领域的应用开拓了新的方法和新的思路。附图说明本专利技术中所用附图是以PLGA微球支架培养人多能干细胞，联合Wnt3α和ActivinA诱导因子，并辅助的在培养基中添加BMP4、HGF和bFGF等因子诱导多能干细胞分化为成熟肝细胞实验数据为代表，进行说明。图1是多能干细胞来源的成熟肝细胞三维诱导分化方案。图2是人多能干细胞从克隆出现到传代的细胞形态变化(1-2代次)。图3是多能干细胞的部分特异性多能Marker表达情况。图4是PLGA微球和PLGA微球支架形态电镜图。图5是人多能干细胞吸附在PLGA微球上生长形态图。图6是PLGA微球支架降解后能够传代的肝细胞样细胞生长形态图。图7是成熟肝细胞部分功能性标志鉴定图。具体实施方式下面根据附图，结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，以更好地理解本专利技术。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例三维培养系统诱导多能干细胞分化为成熟肝细胞本专利技术提供了利用三维细胞培养材料聚乳酸、聚乙醇酸材料等三维细胞培养材料进行处理，和/或联合相关肝向分化诱导因子(包括定型内胚层诱导因子-Wnt3α、激活素A，肝向内胚层诱导因子-骨形成蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子，肝祖细胞诱导因子-肝细胞生长因子，肝细胞成熟诱导因子-肝细胞生长因子)，经过15-30天的诱导，获得成熟肝细胞的方法。具体方案参见图1。1.多能干细胞的培养、扩增和传代1)复苏取出冻存的hiPS细胞，放于37℃温水中快速摇晃，使冰晶快速融化，逐滴加入10倍体积的培养基，用移液器轻轻吹打混匀，800rpm/min离心5min，弃上清，加入4mL新鲜的mTeSR培养基，吹打混匀，加入到预先用处理过30min的六孔板中。每隔2天换一次培养基。2)传代①Ⅳ型胶原酶消化传代法：待集落融合度达到90％左右，或出现“发黄”或分化细胞时，可先用玻璃拉针除去分化细胞，DPBS清洗一次，用1mg/mL的Ⅳ型胶原酶消化15-20min，将集落吹下，加入3-5mL培养基，轻轻吹散成小集落，均匀接种于Matrigel预处理的培养板或皿上；②机械传代法：传代前再倒置相差显微镜下将要需要传代的克隆做好标记，无菌条件下用玻璃拉针将克隆(多用于单个较大克隆传代)机械分离至合适大小，然后用移液器吸出，接种至Matrigel预处理的板上。使用mTeSR培养基，2天更换一次。3)冻存将消化下来的hiPS细胞集落转移至离心管中，轻轻用移液器或巴氏吸管吹打至合适大小，800rpm/min离心5min，弃上清，加入预先配制好的冻存液(70％mTeSR培养基+20％血清替代物+10％细胞培养级DMSO)，混匀，标记好名称、日期和代次，放置在程序降温盒中-80℃过夜，次日转移至-200℃液氮罐中保存。2.人多能干细胞特异性标志的表达鉴定将hiPS细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用三维培养系统获得成熟肝细胞的方法，其特征在于，该方法通过以下技术方案实现：(1)复苏冻存的hiPS细胞，以机械传代法分割、挑取人诱导性多能干细胞；(2)建立三维培养系统，不同阶段加入相应的诱导因子，分阶段高效的诱导人诱导性多能干细胞分化获得成熟肝细胞；(3)经过15‑30天的诱导和扩增，获得具有肝代谢功能的人成熟肝细胞。

【技术特征摘要】
1.一种利用三维培养系统获得成熟肝细胞的方法，其特征在于，该方法通过以下技术方案实现：(1)复苏冻存的hiPS细胞，以机械传代法分割、挑取人诱导性多能干细胞；(2)建立三维培养系统，不同阶段加入相应的诱导因子，分阶段高效的诱导人诱导性多能干细胞分化获得成熟肝细胞；(3)经过15-30天的诱导和扩增，获得具有肝代谢功能的人成熟肝细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的三维培养系统联合多种三维细胞培养基质或细胞培养支架与诱导分化因子及生长因子。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的三维细胞培养基质或细胞培养支架选择由不同浓度、比例的PLGA制成的三维细胞培养材料。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的诱导分化因子及生长因子包括激活素A、Wnt...

【专利技术属性】
技术研发人员：于云飞，彭特，陈勇，蔡亚雄，乔志平，刘樱，
申请(专利权)人：广东艾时代生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东,44