一种伪狂犬病毒JS‑2012株感染性克隆质粒、构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种伪狂犬病毒JS‑2012株感染性克隆质粒、构建方法与应用，以我国新出现的PRV变异株JS‑2012株为基础，利用loxp‑Cre酶系统，在JS‑2012株gG基因终止密码子下游插入pBeloBAC11载体序列，建立了JS‑2012株感染性克隆质粒，并利用galk正反筛选系统对其进行遗传序列操作，建立了变异株JS‑2012株反向遗传操作系统，为深入研究PRV变异株的遗传变异机制、毒力增强、病毒潜伏感染机制及疫苗开发等提供技术平台。

A pseudorabies virus JS 2012 strains of infectious clone plasmid, construction method and Application

The invention provides a pseudo rabies virus JS 2012 strains of infectious clone plasmid, construction method and application in our country, the new PRV variant strain JS 2012 strains as the basis, using loxP Cre enzyme system, the stop codon downstream of gG gene in 2012 strains of JS inserted into pBeloBAC11 vector sequence, a JS 2012 strains of infectious clone plasmid, and the use of galK and screening system for genetic sequences of its operation, a mutant JS 2012 strains of reverse genetic operating system, provide a technical platform for genetic variation mechanism, in-depth study of PRV mutant enhanced virulence, virus latent infection mechanism and vaccine development.

【技术实现步骤摘要】
一种伪狂犬病毒JS-2012株感染性克隆质粒、构建方法与应用
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种伪狂犬病毒感染性克隆质粒及其制备方法和应用。
技术介绍
伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的一种重要动物传染病。PRV能感染多种宿主，但猪是该病毒主要的天然宿主、贮存者和传播者。不同年龄段的猪都可感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率，及种猪不育。PRV属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其基因组为线状双链DNA，长约150kb，由长独特区(UL)、短独特区(US)及US两侧的重复序列所组成，编码70多种蛋白。一些重要的病毒基因，如gE、gI、gG和tk，对病毒毒力存在显著影响，其缺失能使病毒致弱。伪狂犬最早发生于美国，我国于20世纪60年代初在猪群中也出现了该病毒流行，至今PRV仍在我国广泛流行，严重威胁着我国猪群的健康，并造成了严重经济损失。PRV感染猪，除哺乳仔猪呈现高死亡外，其它猪都能耐过。但在耐过猪的外周神经细胞中，存在PRV的潜伏感染。潜伏感染的PRV在一定条件下能被激活，从而成为传染源，这增加了PRV防治的难度。为了控制PRV，我国猪场自上世纪末开始广泛使用PRV弱毒活疫苗，如PRVBartha株活疫苗，猪伪狂犬发病率明显下降。但自2011年以来，许多使用PRV活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等伪狂犬的临床症状。国内多个研究组已证实，我国此次猪伪狂犬病的爆发是由于我国出现了伪狂犬病毒变异株导致的。与经典PRV毒株SC相比，伪狂犬病毒变异株毒力出现增强，Bartha疫苗对变异株不能完全保护。为了有效防控PRV变异株，需要深入研究病毒的遗传变异与毒力增强机制。
技术实现思路
本专利技术以我国新出现的PRV变异株JS-2012株为基础，利用loxp-Cre酶系统，在JS-2012株gG基因终止密码子下游插入pBeloBAC11载体序列，建立了JS-2012株感染性克隆质粒，并利用galk正反筛选系统对其进行遗传序列操作，建立了变异株JS-2012株反向遗传操作系统，为深入研究PRV变异株的遗传变异机制、毒力增强、病毒潜伏感染机制及疫苗开发等提供技术平台。1、通过同源重组方法，在伪狂犬病毒JS-2012株gG基因ORF终止密码子下游插入两翼含有loxp的EGFP表达框，获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP；利用Cre酶及loxp位点，删除EGFP表达框，获得gG基因ORF终止密码子下游插入loxp的重组病毒rJS2012-gG/loxp2、利用Cre-loxp，将在BamHI-HindIII酶切位点间插入EGFP表达框的pBeloBAC11载体重组入rJS2012-gG/loxp中，获得重组病毒rJS2012-BAC，该重组病毒中，pBeloBAC11载体序列位于gG基因下游。3、将rJS2012-BAC感染细胞过程中的基因组DNA电转化DH10B细菌，环状病毒基因含有pBeloBAC11，可在细菌中增殖，通过筛选，获得病毒基因组克隆化的质粒pBAC-JS2012。pBAC-JS2012转染细胞，可产生感染性病毒resJS-BAC，表明JS-2012株基因组克隆质粒pBAC-JS2012具有感染性。利用Cre酶，可删除resJS-BAC中的pBeloBAC11序列，获得resJS-ΔBAC。resJS-ΔBAC具有与亲本病毒JS-2012株相似的体外生长特性和小鼠毒力。4、通过galk筛选基因，在pBAC-JS2012感染性克隆中删除了gE/gI基因，并拯救出gE/gI基因缺失病毒resJS-ΔgE/gI。本专利技术同时提供了一种伪狂犬病毒感染性克隆，所述的伪狂犬病毒感染性克隆是通过以下方法制备得到的：1)通过同源重组方法，在伪狂犬病毒gG基因ORF终止密码子下游插入两翼含有loxp的EGFP表达框，获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP；利用Cre酶及loxp位点，删除EGFP表达框，获得gG基因ORF终止密码子下游插入loxp的重组病毒rJS2012-gG/loxp；2)利用Cre-loxp，将在BamHI-HindIII酶切位点间插入EGFP表达框的pBeloBAC11载体重组入rPRV-gG/loxp中，获得重组病毒rJS2012-BAC，该重组病毒中，pBeloBAC11载体序列位于gG基因下游；3)将rJS2012-BAC感染细胞过程中的基因组DNA电转化DH10B细菌，环状病毒基因含有pBeloBAC11，可在细菌中增殖，通过筛选，获得病毒基因组克隆化的质粒pBAC-JS2012；优选的，其中所述的伪狂犬病毒选自PRV变异株JS-2012株。同时，本专利技术还提供一种利用伪狂犬病毒感染性克隆在制备检测伪狂犬病毒的试剂或药物中的用途；同时，本专利技术还提供一种伪狂犬病毒感染性克隆在制备预防或治疗伪狂犬病毒病生物制品中的用途；同时，本专利技术还提供一种制备gE/gI缺失的伪狂犬病毒感染性克隆的构建方法，所述方法包括如下步骤：1)、获得病毒基因组克隆化的质粒pBAC-JS2012；2)、利用galk正反筛选系统，在PRV感染性克隆pBAC-JS2012上缺失gE/gI基因，获得gE/gI缺失的伪狂犬病毒感染性克隆pBACJS-ΔgE/gI；优选的，其中所述的伪狂犬病毒选自PRV变异株JS-2012株；同时，本专利技术还提供多种利用伪狂犬病毒感染性克隆拯救出的病毒，包括但不限于：resJS-BAC、resJS-ΔBAC、resJS-ΔgE/gI。同时，本专利技术还提供一种区分gE/gI缺失的伪狂犬病毒感染性克隆与自然感染毒株的检测方法，包括以下步骤：使用LgEgIF/RgEgIR为引物进行PCR鉴定，gE/gI缺失的伪狂犬病毒感染性克隆扩增出1000bp的条带，为阳性菌落，而gE/gI非缺失的自然感染毒株扩出2000多bp条带。需要说明的是，这种方法不仅仅针对于JS-2012株的操作，可以应用于多株PRV病毒株，本领域技术人员可以通过常规的实验操作和分子生物学操作，在本专利技术技术方案的启示下，实现其他毒株的相应的操作。附图说明本专利技术将通过例子并参照附图的方式说明，其中：图1是以PRVJS-2012基因组为模板，使用引物PgGF/PgGR和PDgGF/PDgGR分别扩增左右侧同源臂，PCR扩增结果电泳图，其中，1：DNAMarkerDL2000，2：左重组臂，3：右重组臂；图2是使用FuGENE6转染试剂将2ugpTEGGF转染BHK-21细胞绿色荧光图；图3是使用FuGENE6转染试剂将2ugPRVJS-2012基因组与1ugpTEGGF质粒共转染BHK-21细胞绿色荧光图；图4是重组病毒rJS2012-gG/loxpPCR扩增鉴定结果电泳图；图5是重组病毒rJS2012-gG/loxpPCR扩增鉴定结果序列分析图；图6以pEGFP-C3D为模板，使用引物PEGFPF/PEGFPR扩增EGFP表达盒的PCR扩增鉴定结果电泳图，其中，1：DNAMarkerDL2000，2：PCR扩增片段；图7是使用FuGENE6转染试剂将2ugpBeloBAC11-EGFP转染BHK-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种伪狂犬病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：1)通过同源重组方法，在伪狂犬病毒gG基因ORF终止密码子下游插入两翼含有loxp的EGFP表达框，获得重组病毒rJS2012‑gG/EGFP；利用Cre酶及loxp位点，删除EGFP表达框，获得gG基因ORF终止密码子下游插入loxp的重组病毒rJS2012‑gG/loxp；2)利用Cre‑loxp，将在BamHI‑HindIII酶切位点间插入EGFP表达框的pBeloBAC11载体重组入rJS2012‑gG/loxp中，获得重组病毒rJS2012‑BAC，该重组病毒中，pBeloBAC11载体序列位于gG基因下游；3)将rJS2012‑BAC感染细胞过程中的基因组DNA电转化DH10B细菌，环状病毒基因含有pBeloBAC11，可在细菌中增殖，通过筛选，获得病毒基因组克隆化的质粒pBAC‑JS2012。

【技术特征摘要】
1.一种伪狂犬病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：1)通过同源重组方法，在伪狂犬病毒gG基因ORF终止密码子下游插入两翼含有loxp的EGFP表达框，获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP；利用Cre酶及loxp位点，删除EGFP表达框，获得gG基因ORF终止密码子下游插入loxp的重组病毒rJS2012-gG/loxp；2)利用Cre-loxp，将在BamHI-HindIII酶切位点间插入EGFP表达框的pBeloBAC11载体重组入rJS2012-gG/loxp中，获得重组病毒rJS2012-BAC，该重组病毒中，pBeloBAC11载体序列位于gG基因下游；3)将rJS2012-BAC感染细胞过程中的基因组DNA电转化DH10B细菌，环状病毒基因含有pBeloBAC11，可在细菌中增殖，通过筛选，获得病毒基因组克隆化的质粒pBAC-JS2012。2.如权利要求1所述的一种伪狂犬病毒感染性克隆的构建方法，其中所述的伪狂犬病毒选自PRV变异株JS-2012株。3.根据权利要求1或2所述的方法构建的伪狂犬病毒感染性克隆。4.如权利要求3所述的伪狂犬病毒感染性克隆，其特征在于，所述的伪狂犬病...

【专利技术属性】
技术研发人员：童光志，郑浩，王涛，童武，李国新，高飞，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31