本发明专利技术涉及表达HIV-1抗原的重组HSV-1载体,所述载体删除了HSV-1内部反向重复序列（IR），其包括3种重组HSV-1载体，分别表达HIV-1B亚型囊膜糖蛋白gp160、HIV-1C亚型囊膜糖蛋白gp160和HIV-1核衣壳蛋白gag，本发明专利技术还涉及所述载体作为复制型病毒载体疫苗的用途。所述载体的制备包括三个步骤，首先分别将HIV-1B亚型gp160、HIV-1C亚型gp160和HIV-1gagcDNA片段与表达元件巨细胞病毒启动子（PCMV)和牛生长激素基因多聚腺苷酸化信号BGHpA串联后克隆入pKo5/BN获得重组穿梭质粒；随后用所获重组穿梭质粒电转化含pHSVΔIR-BAC的大肠杆菌并筛选获得重组菌；最后从所获重组菌中提取重组DNA并转染Vero细胞，纯化获得重组HSV-1。
【技术实现步骤摘要】
表达HIV-1抗原的重组1型单纯疱疹病毒载体及其制备方法与应用
本专利技术属于生物
，本专利技术涉及表达Hiv-1抗原的重组I型单纯疱疹病毒载体及其制备方法，还涉及所述载体作为复制型病毒载体疫苗的应用。
技术介绍
I型单纯疱疫病毒(Herpes simplex virus type I, HSV-1)是一种嗜神经性病毒，在人群中感染非常普遍，临床表现为黏膜或皮肤局部集聚疱疹等轻微症状，偶尔伴有发热。HSV-1为双链DNA病毒，基因组152kb，由独特长片段(?)和短片段(Us)组成，两端为末端反向重复序列1&和TRs，两片段连接处为内部反向重复序列(IR区)。HSV-1编码约90种蛋白，功能大多已明确，其中约一半为病毒复制所必需，另一些为复制非必需，这些非必需基因删除并代之以外源基因不影响病毒复制，故HSV-1可改造为病毒载体。HSV-1载体的优势在于其宿主范围广、感染效率高、安全(基因组游离存在；抗疱疹病毒药物可终止治疗和意外感染)、容量大、易于制备、所携载的外源基因可持续表达；小鼠等动物感染HSV-1的症状类似于人，可作为HSV-1载体研究的动物模型；遗传背景清楚，重组方法成熟。目前，HSV-1作为溶瘤病毒和疫苗载体已有广泛的基础和临床研究。目前，已有几种成熟的方法可以获得重组HSV-1。最早的重组HSV-1是通过诱变法获得，其局限性在于诱变产生的突变体大多为不需要的，从中筛选出所需HSV-1突变株非常困难。二十世纪80年代，同源重组法开始用于构建重组HSV-1，即将一个带有标记基因和靶基因的质粒与野生型HSV-1基因组共转染宿主细胞，在宿主细胞内发生同源重组，并通过表达的标记基因从子代病毒中筛选出重组体。同源重组法突变方向明确，筛选容易，较诱变法有明显的优势。即便如此，重组HSV-1的获得仍是一项费时费力的工作，构建一株重组病毒常需耗时一年。而野生型病毒增殖能力显著高于突变株时，就很难筛选出突变的病毒株；如果突变缺失的是病毒增殖必需基因，则需要在互补细胞系中增殖重组病毒，这又使重组体筛选更加繁琐。随着人类基因组学研究的深入，大容量载体系统逐渐被建立，这些工具不但用于哺乳动物细胞基因的研究，也极大地方便了大病毒基因组的研究。其中，在病毒学中最常用的是细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)。BAC在宿主菌中仅有1-2个拷贝，遗传性能稳定，且可通过电激转化宿主菌，常规方法即可从宿主菌中分离BAC-DNA,继而转染宿主细胞并获得HSV-1。目前，疱疹病毒科的所有成员都已被克隆至BAC中，这些病毒BAC保留了病毒的感染特性，其转染相应细胞后能够复制并释放子代病毒，而且用于大肠杆菌的基因工程方法也适用于病毒BAC的操作，这一技术极大地加快了获得重组HSV-1的速度。 HSV-1作为溶瘤病毒的历史较长，作为疫苗载体的研究起步较晚，自上世纪90年代初Roizman提出HSV-1载体可用于预防HSV感染后，研究者们对HSV-1作为疫苗载体开展了系列研究，证实HSV-1作为疫苗载体具有独特的优势，如=HSV-1初次感染后潜伏于体内，机体针对HSV-1的预存免疫很低；表达抗原基因的重组HSV-1能激发小鼠产生持久的免疫反应；HSV-1载体可通过口服和黏膜免疫激发机体全面的免疫应答；HSV-1载体能激发机体的固有免疫反应，具有佐剂功能等。人类免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus, HIV)感染机体后主要侵犯CD4+ T细胞，导致机体免疫缺陷并继发各种机会性感染和肿瘤。自首例艾滋病报道以来，全球科学家一直致力于艾滋病疫苗的研制。针对HIV这类高度变异、攻击免疫系统且能引起持续感染和产生免疫病理反应的病毒而言，研制能有效诱导机体全面免疫反应的疫苗尤为重要。目前，HIV病毒样颗粒疫苗、亚单位疫苗、合成多肽疫苗、DNA疫苗、细菌活载体疫苗和病毒载体疫苗均见报道，上述疫苗在非人类灵长类动物模型中均可引起不同程度的免疫保护反应。目前，以HSV-1为载体的HIV-1疫苗已有报道。Amitinder Kaur等借助HSV-1载体表达猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus, SIV) gag、env 和 tat-rev-nef 融合蛋白，该载体为复制缺陷型，通过DNA初免-病毒加强的策略免疫恒河猴，诱导出有效的抗gag和抗env的细胞免疫反应，且对SIV攻毒具有保护效果。Knipe等将SIV的多个基因重组至缺失了 ICP4，ICP22和ICP27的复制缺陷型HSV-1载体dl06中，该重组病毒能诱导短尾猴产生针对SIV的中和抗体和细胞免疫反应，攻毒后免疫组的病毒载量减少，但dl06携载的SIV基因在感染细胞中的表达水平很低，诱导的免疫应答水平不高，该研究组正着手恢复dl06中的部分IE基因以提高病毒载体的复制能力。复制型HSV-1载体缺失或突变了病毒复制的非必需基因，在降低病毒毒性的同时保留了病毒的复制能力，这类载体携载外源抗原感染细胞后可持续复制并表外源基因，从而诱导机体免疫反应。Parker等构建了删除双拷贝ICP34.5并表达HIV-1 gag的复制型HSV-1载体，该载体通过腹腔免疫小鼠后，可诱导出很强的gag特异性的细胞免疫反应，且免疫反应可持续至少9个月。Cynthia等以表达SIV包膜蛋白和nef蛋白的复制型HSV-1载体疫苗免疫恒河猴，免疫动物均产生了SIV特异性的抗体和CTL反应。
技术实现思路
本专利技术构建了表达HIV-1抗原的重组HSV-1载体，所述载体删除了 HSV-1内部反向重复序列(IR)，共包括3种重组HSV-1载体，分别表达HIV-1 B亚型囊膜糖蛋白gpl60、HIV-1 C亚型囊膜糖蛋白gpl60和HIV-1核衣壳蛋白gag，上述载体可作为预防HIV-1感染的复制型病毒载体疫苗。本专利技术构建表达HIV-1抗原的重组HSV-1载体过程中用到的穿梭质粒pKo5/BN和缺失了 IR区HSV-1基因组的细菌人工染色体质粒pHSVDIR-BAC及其转化的大肠杆菌菌株为本研究组前期构建并保存。本专利技术还建立了上述表达HIV-1抗原的重组HSV-1载体的制备方法，具体步骤包括: 1.构建Hiv-1抗原基因的穿梭质粒 分别将HIV-1 B亚型gpl60、HIV-l C亚型gpl60和HIV-1 gag基因的cDNA片段与表达元件串联后克隆入pKo5/BN获得重组穿梭质粒，多种限制性酶切鉴定穿梭质粒。2.筛选携载HIV-1抗原基因的HSV-1细菌人工染色体 上述步骤构建的穿梭质粒电转化含有pHSVDIR-BAC的大肠杆菌感受态细胞，通过抗生素抗性和生化筛选获得发生同源重组的重组菌株，经菌落PCR和Southern blotting鉴定获得含HIV-1抗原基因的的重组DNA，大量提取纯化重组DNA。3.蚀斑法分离和纯化表达HIV-1抗原的重组HSV-1 用上述步骤筛选的携载HIV-1抗原基因的HSV-1细菌人工染色体DNA转染vero细胞，通过蚀斑挑选、纯化以及病毒鉴定最终获得表达HIV-1抗原的重组HSV-1。本专利技术构建的表达HIV-1抗原的重组HSV-1载体结本文档来自技高网...
【技术保护点】
表达HIV‑1抗原的重组HSV‑1载体，包括3种重组HSV‑1载体，其特征在于，所述3种载体分别表达HIV‑1 B亚型gp160、HIV‑1 C亚型gp160和HIV‑1 gag。
【技术特征摘要】
1.表达HIV-1抗原的重组HSV-1载体，包括3种重组HSV-1载体，其特征在于，所述3种载体分别表达HIV-1 B亚型gpl60、HIV-1 C亚型gpl60和HIV-1 gag。2.根据权利要求1所述的表达HIV-1抗原的重组HSV-1载体，其特征在于，所述载体删除了 HSV-1内部反向重复序列(IR)，其包括HSV-1三个早期基因(ICP0、ICP4和ICP22)、神经毒性基因Y 34.5和病毒潜伏相关转录本LAT在内的15351bp的DNA片段。3.根据权利要求1所述的表达HIV-1B亚型gpl60的重组HSV-1载体，其特征在于，所述载体包含HIV-1 B亚型gpl60基因的全长cDNA，并在其前插入巨细胞病毒启动子Pcmv,在其后插入牛生长激素基因多聚腺苷酸化信号序列BGHpA。4.根据权利要求1所述的表达HIV-1C亚型gpl60的重组HSV-1载体，其特征在于，所述载体包含HIV-1 C亚型gpl60基因的全长cDNA，并在其前插入巨细胞病毒启动子Pcmv,在其...
【专利技术属性】
技术研发人员：马正海，赵晓飞，
申请(专利权)人：新疆大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65
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