一种制备单克隆抗体的小鼠模型建立方法技术

本发明专利技术公开了一种制备单克隆抗体的小鼠模型建立方法，首先将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株从种子库取出解冻培养，进行细胞预处理及计数；然后将杂交瘤细胞株注射进第一批小鼠腹腔中，形成一代小鼠模型；注射后第6天，开始进行腹水采集；将第一次采集的一代小鼠模型的腹水注射进第二批小鼠腹腔中，形成二代小鼠模型；重复上述步骤，依次得到第三代至第十代小鼠模型。本发明专利技术的优点在于流程简单，操作便捷，安全性高。提高了整体的工作效率，节约了单克隆抗体制备的成本，也避免了细胞培养过程中的复杂性操作及杂交瘤细胞在培养过程中污染的风险，便于后期持续性大量获取鼠源性的单克隆抗体用于医疗体外诊断行业。

Mouse model building method for preparing monoclonal antibody

The invention discloses a method for establishing a mouse model for the preparation of monoclonal antibody, hybridoma cell lines secreting monoclonal antibody from the seed bank to remove the thaw in cultivation, processing and counting cell; then the hybridoma cell lines were injected into the first batch of mice, a mouse model of generation; sixth days after injection to begin, ascites collection; the first generation mouse model collected ascites injected into the second batch of mice in the formation of the two generation mouse model; repeat the above steps, in order to get third to tenth generations of mice model. The invention has the advantages of simple process, convenient operation and high safety. To improve the overall work efficiency, saving the cost of the preparation of monoclonal antibodies, cell culture also avoids the complexity in the process of operation and the hybridoma cell at the risk of pollution in the process of training, to obtain a large number of late monoclonal antibody persistent mouse source for in vitro diagnostic medical industry.

【技术实现步骤摘要】
一种制备单克隆抗体的小鼠模型建立方法
本专利技术涉及单克隆抗体的制备技术，尤其是涉及一种可获取大量鼠源性单克隆抗体的小鼠模型建立方法。
技术介绍
1975年Kohler和Milstein建立了杂交瘤技术，将小鼠骨髓瘤细胞与产生绵羊红细胞的小鼠脾细胞融合，形成的杂交瘤细胞既能产生抗体又能进行分裂繁殖，且产生的抗体只能识别一种抗原决定簇，称为单克隆抗体。目前单克隆抗体主要应用于疾病的预防、诊断和治疗，生物物质的纯化及蛋白结构功能的研究中。治疗性单抗（单克隆抗体）的市场在新药开发中有逐年增长的趋势，1997年单抗的销售额是50亿美金，以后每年都有40%到50%的增长，至2003年已达到1997年的十倍，达500亿美金，由此可见单抗技术是生物
中升起的一颗新星。随着对单克隆抗体药物研究的不断深入以及新药的不断推出，单克隆抗体药一直处于较高的增长率。单克隆抗体不仅在体外诊断试剂上得以广泛应用，还可直接用于对人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔的前景。我国的单克隆抗体药物从无到有发展迅速，已在我国医药市场发挥着越来越重要的作用，但是单克隆抗体在我国市场仍属高端产品，主要依赖进口。目前在国内外实验室广泛采用的制备单抗的方法主要有两大系统，一是体外培养法；二是动物体内生产法。杂交瘤细胞系并不是严格的贴壁依赖细胞（anchoragedependentcell，ADC），因此既可以进行单层细胞培养，又可以进行悬浮培养。目前杂交瘤细胞的单层细胞培养法是各个实验室最常用的体外培养手段，即将杂交瘤细胞加入培养瓶中，以含20%小牛血清的培养基培养，细胞浓度以1×106-2×106/ml为佳，然后收集培养上清，其中单抗含量约10-50ug/ml。显然，这种方法制备的单抗量极为有限，无疑是不适用于单抗的大规模生产。要想在体外大量制备单抗，就必须进行杂交瘤细胞的大量（高密度）培养。因为单位体积内细胞数量越多，细胞存活时间越长，单抗的浓度就越高，产量就越大。目前对于杂交瘤细胞的大量培养方法包括以下几种：1、悬浮培养法：即小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器，美国、加拿大、法国和德国等几家公司生产这类反应器，其培养方式可分为纯批式、流加式、半连续式和连续式。2、微载体培养法：微载体（Microcarrier）是以小的固体颗粒作为细胞生长的载体，在搅拌作用下微载体悬浮于培养液中，细胞则在固体颗粒表面生长成单层。可用作细胞大量培养的微载体主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品，其中以CytodexI，Biosilon和Superbeads为好。3、中空纤维细胞培养系统：该系统由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵等组成。尽管该培养系统在大规模生产单抗时成本较低，并可获得高产量高纯度的抗体，但是由于设备价格昂贵，限制了其使用范围。4、微囊化细胞培养系统：该系统是先将杂交瘤细胞微囊化，然后将此具有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得高浓度的单抗。5、杂交瘤细胞的无血清培养：杂交瘤细胞的体外培养绝大多数应用DMEM或RPMI-1640为基础培养基，添加10-20%胎牛或新生小牛血清。由于血清中含有上百种的蛋白质，这给单抗的纯化带来很大麻烦，而未纯化的含有异种蛋白的单抗用于动物治疗可诱发变态反应。无血清培养的实质就是用各种不同的添加剂来代替血清，然后进行杂交瘤细胞的培养。采用无血清培养基培养杂交瘤细胞制备单抗，有利于单抗的纯化，有助于大规模生产，可减少细胞污染的机会，且成本较低。但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单抗的产量；同时无血清培养基还缺少血清中保护细胞免受环境中蛋白酶损伤的抑制因子等。虽然以上体外培养生产单抗的方法随着技术的不断发展会趋于更加完善，但依然无法代替从动物体内获取单克隆抗体。动物体内生产单抗：鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首选BALB/c小鼠。通过将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。虽然该方法操作简便、经济，但是传统的注射方式使得小鼠产生腹水率较低，且需要不断的进行体外培养和免疫注射，实际实验操作成本较高且流程复杂，并不利于大规模化生产，导致临床试验及医药成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可获取大量鼠源性单克隆抗体的小鼠模型建立方法。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案：本专利技术所述的制备单克隆抗体的小鼠模型建立方法包括下述步骤：第一步，将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株从种子库取出解冻，并培养至对数生长期，然后进行细胞预处理及计数；第二步，将第一步处理好的杂交瘤细胞株注射进8~10周龄的第一批BALB/c小鼠腹腔中，形成一代小鼠模型；第三步，注射后第6天，观察一代小鼠模型情况并进行腹水采集；第四步，将第三步中第一次采集的一代小鼠模型的腹水注射进8-10周龄的第二批BALB/c小鼠腹腔中，形成二代小鼠模型；第五步，重复第三步和第四步，依次得到第三代至第十代小鼠模型。所述使用的BALB/c小鼠在使用前采用降植烷或液体石蜡对其腹腔进行预处理。所述BALB/c小鼠采用SPF级小鼠。本专利技术的优点在于流程简单，操作便捷，安全性高。可保证杂交瘤细胞在第一代小鼠模型腹腔内大量繁殖并分泌有效的抗体，取自上一代小鼠模型的腹水注射在下一代小鼠模型腹腔内，腹水产生的周期较常规注射杂交瘤细胞的BALB/c小鼠腹水提前2-3天，同时小鼠注射杂交瘤细胞后产生腹水的成功率也由86%提高到98%以上，利用本专利技术建立的小鼠模型制备单克隆抗体，不仅缩短了获取鼠源性单克隆抗体制备的周期，保证了BALB/c小鼠的有效利用率，提高了整体的工作效率，节约了单克隆抗体制备的成本，也避免了细胞培养过程中的复杂性操作及杂交瘤细胞在培养过程中污染的风险，便于后期持续性大量获取鼠源性的单克隆抗体用于医疗体外诊断行业。具体实施方式下面对本专利技术制备单克隆抗体的小鼠模型建立方法进行更加详细的说明。本专利技术的制备单克隆抗体的小鼠模型建立方法包括下述步骤：第一步，将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株从种子库取出解冻，为保证杂交瘤细胞株的成活率可采用快速解冻法（即从冷库中取出后快速放在预热好的37℃水浴锅内进行解冻，保证在50s内完成），然后将解冻后的杂交瘤细胞株用提前配制好的无血清培养基清洗两遍（每毫升杂交瘤细胞液加入6毫升DMEM培养基，然后用移液枪进行悬浮后1500r/min，3min离心，去上清，共重复两遍），有效去除杂交瘤细胞冻存液中的二甲基亚砜等有毒物质，保证解冻后的杂交瘤细胞成活率；然后用将添加有40%小牛血清和添加有饲养细胞的培养基对清洗后的杂交瘤细胞重悬后在平皿里培养4-7天，并每天定期观察杂交瘤细胞的生产状态；第二步，当观察分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞生长到对数生长期的时候（一般在倒置显微镜下观察细胞数量覆盖平皿底部的3/4面积，并且细胞状态良好即为细胞生长对数期），对杂交瘤细胞开始重悬（因为杂交瘤细胞为半贴壁半本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备单克隆抗体的小鼠模型建立方法，其特征在于：包括下述步骤：第一步，将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株从种子库取出解冻，并培养至对数生长期，然后进行细胞预处理及计数；第二步，将第一步处理好的杂交瘤细胞株注射进8~10周龄的第一批BALB/c小鼠腹腔中，形成一代小鼠模型；第三步，注射后第6天，观察一代小鼠模型情况并进行腹水采集；第四步，将第三步中第一次采集的一代小鼠模型的腹水注射进8‑10周龄的第二批BALB/c小鼠腹腔中，形成二代小鼠模型；第五步，重复第三步和第四步，依次得到第三代至第十代小鼠模型。

【技术特征摘要】
1.一种制备单克隆抗体的小鼠模型建立方法，其特征在于：包括下述步骤：第一步，将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株从种子库取出解冻，并培养至对数生长期，然后进行细胞预处理及计数；第二步，将第一步处理好的杂交瘤细胞株注射进8~10周龄的第一批BALB/c小鼠腹腔中，形成一代小鼠模型；第三步，注射后第6天，观察一代小鼠模型情况并进行腹水采集；第四步，将第三步中第一次采集的一代小鼠模型的腹水...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛晓旭，赵巧辉，张文婧，李桂林，郑艳丽，付光宇，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41