【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸引物探针质量检测领域，具体涉及寡核苷酸的hplc检测方法。
技术介绍
1、寡核苷酸属于酸性强极性化合，在一般色谱柱上很难保留。针对寡核苷酸色谱法主要有离子对反相色谱(rp-rplc)、离子交换色谱(iec)、亲水作用色谱(hilic)。其中离子对反相色谱法最为常用，离子对试剂增强寡核苷酸在反相色谱上的保留原理主要基于两点：首先，带正电的离子对试剂会与带负电的寡核苷酸磷酸骨架在溶液中构成离子对，减少了寡核苷酸的净电荷并增加了其疏水性，此时疏水相互作用促成了寡核苷酸在离子对反相色谱中的保留；再者，离子对试剂依靠其疏水性烷基链可以吸附于反相色谱的固定相上以形成离子交换剂(ion exchanger)，此时静电相互作用将帮助寡核苷酸在反相色谱中的保留。
2、寡核苷酸是由固相化学合成法制成。在合成过程中会产生工艺相关杂质和产品相关杂质。产品相关杂质包含许多目标产物的类似物(分子量的差别：碱基数n-1、n、n+1等)，磷酸基s化等的不对称化合物、异构体等。因此，杂质的分析监控对工艺和质量控制就显得十分重要。
3、目前寡核苷酸纯度gb/t 34797-2017(核酸引物探针质量技术要求)检测方法为hplc-rp检测，该方法主要适用于长度＜30个碱基的短链寡核苷酸纯度分析，对于长度＞30个碱基寡核苷酸及短链寡核苷酸粗品n-1杂质的分离度效果不佳。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供寡核苷酸的hplc检测方法。
2、本
3、所述hplc的检测条件包括：
4、流动相a包括：0.05m teab、体积分数为1‰的tfa和水；
5、流动相b包括：乙腈；
6、洗脱程序为：
7、0～25min，流动相b的体积分数为5％至15％；
8、25～26min，流动相b的体积分数为15％至90％；
9、26～30min，流动相b的体积分数为90％；
10、30～31min，流动相b的体积分数为90至5％；
11、31～35min，流动相b的体积分数为5％。
12、所述hplc检测的色谱柱为agilent advancebio oligonucleotides色谱柱。
13、所述agilent advancebio oligonucleotides色谱柱长度为150mm，内径为2.1mm。
14、所述agilent advancebio oligonucleotides色谱柱填料为十八烷基硅烷键合多孔硅胶，填料粒径为2.7μm。
15、进一步的，
16、所述的hplc检测方法中，
17、所述流动相a的ph值为7.5。
18、所述hplc检测的进样体积为10μl，柱温为60℃，流速为0.3ml/min。
19、所述hplc检测波长为260nm。
20、所述过滤使用滤膜，所述滤膜的滤径为0.22μm。
21、更进一步的，本专利技术所述检测包括获得样品纯度，所述样品纯度通过采用本专利技术所述的hplc检测方法对样品进行检测，获得样品色谱图，设置色谱积分参数及面积归一化后得到。
22、所述积分参数设置为：切线撇去模式设置为新指数，拖尾峰撇去高度比为5，前伸峰撇去高度比为5，撇去峰/谷比为20，基线校正设置为经典，峰谷比为500，斜率灵敏度为1，峰宽为0.5，最小峰面积为1，最小峰高为1.7，肩峰设置为关闭，0min积分设置为关，5min积分设置为开，25min积分设置为关。
23、本专利技术所述的hplc检测方法中，所述寡核苷酸为长度为15～60个碱基。
24、本专利技术中，对所述寡核苷酸的hplc分离检测方法的流动相进行了优化，结果表明，流动相中不含有改性剂tfa和含有其他改性剂的分离度均没有含有1‰改性剂tfa的好，流动相中加入1‰tfa改性剂，分离度为3.033；流动相中加入1‰hfip改性剂，分离度为2.527；流动相中未加改性剂，分离度为2.474；且本专利技术对洗脱程序做了优化，试验结果表明，以本专利技术所述的洗脱程序的洗脱效果最好、分离效果最佳。本专利技术的流动相与洗脱程序配合对寡核苷酸进行分离纯化，达到了较好的分离效果。
25、本专利技术所述的hplc检测方法中，所述寡核苷酸为长度为15～60个碱基。
26、本专利技术公开了寡核苷酸的hplc检测方法，本方法主要借助小粒径十八烷基硅烷键合多孔硅胶填料色谱柱，利用0.05m teab ph7.5作为流动相a，同时添加1‰tfa，乙腈作为流动相b；将分析梯度优化为0～25min，5％～15％ b相，柱温设置为60℃；可高效分离15～60个碱基寡核苷酸n和n-1，补充了现有分析方法的局限性。本专利技术的检测方法分辨率更高、且适用范围更广，测定结果更为准确可靠，可以更有效对核酸引物探针质量进行分析控制。
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1.寡核苷酸的HPLC检测方法，其特征在于，样品经过滤后，采用HPLC进行检测：
2.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述HPLC检测的色谱柱为Agilent AdvanceBio Oligonucleotides色谱柱。
3.根据权利要求1或2所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述Agilent AdvanceBioOligonucleotides色谱柱长度为150mm，内径为2.1mm。
4.根据权利要求1～3任一项所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述AgilentAdvanceBio Oligonucleotides色谱柱填料为十八烷基硅烷键合多孔硅胶，填料粒径为2.7μm。
5.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述流动相A的pH值为7.5。
6.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述HPLC检测的进样体积为10μL，柱温为60℃，流速为0.3mL/min。
7.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述HPLC检测波长为260nm。
8.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述过滤使用滤膜，所述滤膜的滤径为0.22μm。
9.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述检测包括获得样品纯度，所述样品纯度通过采用权利要求1～8任一项所述的HPLC检测方法对样品进行检测，获得样品色谱图，设置色谱积分参数及面积归一化后得到。
10.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述寡核苷酸为长度为15～60个碱基。
...【技术特征摘要】
1.寡核苷酸的hplc检测方法，其特征在于，样品经过滤后，采用hplc进行检测：
2.根据权利要求1所述的hplc检测方法，其特征在于，所述hplc检测的色谱柱为agilent advancebio oligonucleotides色谱柱。
3.根据权利要求1或2所述的hplc检测方法，其特征在于，所述agilent advancebiooligonucleotides色谱柱长度为150mm，内径为2.1mm。
4.根据权利要求1～3任一项所述的hplc检测方法，其特征在于，所述agilentadvancebio oligonucleotides色谱柱填料为十八烷基硅烷键合多孔硅胶，填料粒径为2.7μm。
5.根据权利要求1所述的hplc检测方法，其特征在于，所述流...
【专利技术属性】
技术研发人员：谷梦思，王晓姣，董振彬，刘光辉，苏测洋，赵巧辉，李桂林，付光宇，杨增利，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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