【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体涉及重组probnp蛋白突变体及其应用。
技术介绍
1、心血管疾病包括心力衰竭、心律失常、冠心病、风湿性心脏病、动脉粥样硬化、心房颤动等，占当前全世界疾病死亡原因的30％左右，是最常见的疾病死亡原因之一。心血管疾病中，心力衰竭的死亡率、发病率和医疗保健费用最高，近年来全球的直接医疗总成本约达200亿美元。现有诊断和疾病管理技术的不足导致在不同的社会经济阶层、性别和年龄组中心力衰竭的死亡率和发病率都很高。根据美国心脏病学会基金会/美国心脏协会和欧洲心脏病学会发布的指南，b型利钠肽(bnp)和bnp的n末端激素原(nt-probnp)被认为是诊断心力衰竭和心脏功能障碍类疾病最有价值和最可靠的生物标志物，它们还可用于确定疾病严重程度、指导相关治疗策略以及预后评估。此外，bnp和nt-probnp在心脏损伤之前的心功能代偿阶段即可检测到变化，有利于更早的发现心脏功能异常，而其它心脏疾病标志物如肌红蛋白、肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶等由于心脏损伤而释放，必须在心脏损伤后才能有效监测。
2、bnp于1988年首先从猪脑组织中分离得到，最初被命名为脑利钠肽，但随后的研究表明，bnp主要由左心室中的肌细胞合成和分泌。人bnp是一种由32个氨基酸组成的多肽，包含一个17个氨基酸组成的环状结构，其中两个半胱氨酸残基连接形成一对二硫键。人类编码bnp的基因位于i号染色体，编码bnp的mrna含有不稳定的重复序列tatttat。在病理条件下，不稳定的bnp mrna可以快速翻译合成一条含有134个氨基酸的前体蛋白pr
3、nt-probnp和bnp由同一种物质probnp裂解产生，都用于检测心脏类疾病，但是，nt-probnp和bnp在实际测定过程中常使用两种不同的物质作为标准品，如两者分别使用nt-probnp和bnp的合成多肽或重组蛋白作为校准物质。nt-probnp和bnp商品化试剂盒检测结果之间常出现显著差异，使得检测结果的解读更加复杂，缺乏通用的校准物质是引发该问题的主要原因之一。
4、probnp包含nt-probnp和bnp的全部氨基酸序列，可同时用于两种试剂盒的校准物质，但血浆中probnp含量低微，难以纯化得到天然probnp。直接合成多肽成本过高，且存在不稳定、保存困难等问题。probnp是一种包含七个o-糖基化位点(thr36、ser37、ser44、thr48、ser53、thr58和thr71)的蛋白质，o-糖基化对probnp蛋白的性质有多种方面的影响。例如，seferian等证明了人probnp的糖基化会不同程度地干扰probnp与相应表位的抗体之间的免疫亲和反应，导致用于nt-probnp和bnp商品化试剂盒检测时测值很低；semenov等证实了人probnp的thr71位点的糖基化修饰对蛋白质的整体稳定性至关重要，thr71位点缺乏糖基化时probnp极易被分解；nishikimi等认为人体中probnp裂解位点和o-糖基化位点之间的氨基酸个数影响最终的蛋白糖基化程度；nakagawa等发现probnp两个糖基化位点thr48和thr71可协同作用，减弱心肌细胞中的probnp成熟度并增加其分泌量。
5、当前，已有研究尝试开发可同时用于nt-probnp和bnp检测的重组probnp糖蛋白，但用于nt-probnp检测中的校准物质时，由于过量的o-糖基化可能干扰检测抗体与重组probnp之间的结合，故常存在校准品效价过低的问题，造成检测试剂开发不便，间接导致整体检测费用高昂，不利于普及推广，惠及大众
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供重组probnp蛋白突变体及其应用，本专利技术通过构建重组质粒对probnp蛋白进行了改造，提高了probnp蛋白的效价，可用于nt-probnp试剂盒和bnp试剂盒检测的通用校准物质。
2、本专利技术提供了probnp蛋白的突变体，野生型probnp蛋白的第44位氨基酸被丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸和酪氨酸中的任意一种取代；
3、所述野生型probnp蛋白具有如seq id no:1所示的氨基酸序列。
4、在一些实施例中，野生型probnp蛋白的第44位氨基酸被丙氨酸取代。
5、本专利技术所述突变体的氨基酸序列如seq id no:2所示。
6、实验证明，相比较天然probnp蛋白、probnp蛋白其他位点氨基酸的突变获得的、probnp蛋白突变体，本专利技术提供的probnp蛋白的突变体作为nt-probnp试剂盒检测校准物质的效价明显提高，同时也可用于bnp试剂盒检测的通用校准物质，从而获得更准确的技术效果，具有更好的应用前景。
7、本专利技术提供了编码所述突变体的核酸。
8、本专利技术提供了包含所述核酸的表达载体。
9、本专利技术所述的表达载体能够在宿主细胞体内表达产生所述probnp蛋白的突变体。在一些实施例中，所述表达载体的骨架载体包括pcmv载体。
10、本专利技术提供了转化或转染所述表达载体的宿主细胞。
11、本专利技术所述的宿主细胞选自大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞包括大肠杆菌dh5α和hek293细胞。
12、本专利技术提供了所述突变体的制备方法，包括：培养所述的宿主细胞，获得含有所述突变体的培养物。
13、在一些实施例中，所述制备方法还包括纯化的步骤，所述培养物经离子交换层析、疏水层析、亲和层析和浓缩洗虑中的至少一种纯化方法获得纯化后的所述突变体。
14、在一些具体实施例中，所述例子交换层析为sp强阳离子交换层析。
15、本专利技术提供了如下①～⑤中至少一项在制备人体b型利钠肽或bnp的n末端激素原检测试剂或试剂盒中的应用：
16、①、所述的突变体；
17、②、所述的核酸；
18、③、所述的表达载体；
19、④、所述的宿主细胞；
20、⑤、所述的制备方法制得的培养物。
21、本专利技术提供了人体b型利钠肽或bnp的n末端激素原检测试剂或试剂盒，包括如下ⅰ～ⅴ中至少一项：
22、ⅰ、所述的突变体；
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【技术保护点】
1.proBNP蛋白的突变体，其特征在于，野生型proBNP蛋白的第44位氨基酸被丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸和酪氨酸中的任意一种取代；
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，野生型proBNP蛋白的第44位氨基酸被丙氨酸取代。
3.根据权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
4.编码权利要求1～3任一项所述突变体的核酸。
5.包含权利要求4所述核酸的表达载体。
6.转化或转染权利要求5所述表达载体的宿主细胞。
7.权利要求1～3任一项所述突变体的制备方法，其特征在于，包括：培养如权利要求6所述的宿主细胞，获得含有所述突变体的培养物。
8.根据权利要去7所述的制备方法，其特征在于，还包括纯化的步骤，所述培养物经离子交换层析、疏水层析、亲和层析和浓缩洗虑中的至少一种纯化方法获得纯化后的所述突变体。
9.如下①～⑤中至少一项在制备人体B型利钠肽或BNP的N末端激素原检测试剂或试剂盒中的应用：
10.人体B型利钠肽或BNP的N
...【技术特征摘要】
1.probnp蛋白的突变体，其特征在于，野生型probnp蛋白的第44位氨基酸被丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸和酪氨酸中的任意一种取代；
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，野生型probnp蛋白的第44位氨基酸被丙氨酸取代。
3.根据权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seq idno:2所示。
4.编码权利要求1～3任一项所述突变体的核酸。
5.包含权利要求4所述核酸的表达载体。
6.转化或转染权利要求5所述表达载体的宿主细胞。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：周清华，徐延伟，赵巧辉，任雪飞，李桂林，付光宇，杨增利，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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