一种小鼠原发性肝癌模型的建立方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种以研究肝癌发生发展机制及抗肿瘤药物开发为目的的小鼠原发性肝癌模型的建立方法。从ＨｅｐＳ腹水癌小鼠腹腔内抽取腹水，分离细胞并制成细胞悬液，打开小鼠腹腔，用微量注射器抽取细胞悬液注射入小鼠肝脏，用７５％酒精棉签按压针孔至肝脏表面不再渗血，用α－氰基丙烯酸盐乙酯粘合剂封闭针孔，再以生理盐水冲洗肝脏表面，分层关腹。结果显示模型小鼠肝癌发生率为１００％，自然消退率为零。该模型是一种可以用于研究原发性肝癌发生发展的机制、同时也适用于抗肿瘤药物开发、肝癌的实验性治疗及诊断研究的理想的原发性肝癌模型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种以研究肝癌发生发展机制及抗肿瘤药物开发为目的的小鼠原发性肝癌模型的建立方法。二.
技术介绍
原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，其死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中居第三位。我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％，肝癌的治疗亟待进步。理想的肝癌动物模型是抗肿瘤药物开发、肝癌发生发展机制及诊断治疗研究必不可少的实验工具。故成功地制作肝癌实验动物模型，对于肝癌相关实验研究的开展起着至关重要的作用。原位肝癌动物模型的建立方法大致分为四类，即自发性肝癌模型、诱发性肝癌模型、移植性肝癌模型和转基因动物肝癌模型，模型动物最常见为鼠。自发性肝癌模型在发生学上与人类肝癌相似，但发生率低且不稳定，发生时间较难预测且参差不齐，荷瘤动物在动物个体(性别、体重、肿瘤发生时间等)和肿瘤(大小、数目、部位等)两方面差异较大；诱发性肝癌模型最为常用，多采用化学药物诱发，但诱导周期长(3～5月，甚至1～2年)，操作烦琐，死亡率高，肝癌出现的时间、部位、病灶数等在个体之间表现不均一，而且这些化学药物多易挥发，有难闻的气味，除致癌作用外还有化学毒性，会对试验动物和实验操作者自身造成伤害；转基因动物肝癌模型制作技术要求极高，价格昂贵，国内开展的尚较少。原位移植性肝癌模型周期短、成功率高，是一种较好的动物肿瘤模型。目前移植性肝癌模型根据植入物可分为瘤组织块肝原位移植和细胞悬液肝原位移植。韩克起等人用H22细胞株接种于ICR小鼠皮下形成实体瘤，再将瘤组织接种于小鼠肝内形成肝原位移植瘤模型。在韩等的实验中，制作程序繁琐，成功率较低，且该模型需先在小鼠皮下种植形成实体瘤，故每次实验内移植的瘤组织块不能来自于同一鼠体，切割的组织块大小不易一致，内容物不均一，且含有其他非癌组织，这会严重影响实验的重复性和可靠性，并不能完全真实反映抗肝癌药物的作用效果。李琦等和邵成伟等采用Walker-256细胞肝内注射建立了大鼠移植型肝癌模型，模型采用的Walker-256细胞株在植入肝内后，虽能较好地模拟人肝癌的膨胀性和浸润性生长方式，但该细胞株来源于Wistar大鼠乳腺自发的癌肉瘤，而非肝癌组织，故该模型不能很好的模拟肝癌的发生发展过程，更不能满足抗肝癌药物研发筛选、肝癌分子生物学研究的需要。加之大鼠价格较贵且需要较大的饲养空间，不易大批制作。现有的人-裸小鼠异种移植性肝癌模型虽有较高的移植成功率，但裸小鼠免疫系统缺陷，不能反映正常生物体的真实情况，无法研究免疫系统在肝癌发生中的作用以及对肝癌后续发展的影响，不能模拟药物在机体中的正常代谢。另外裸鼠-人肝癌移植模型技术要求高，裸鼠术后成活率低，且无菌要求高、饲养困难、价格昂贵，因此这种模型的实用性受到了很大的限制。已存在的各种肝癌动物模型都有一定的缺陷，无法满足目前生物医药领域的需求。三.
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是建立一种原发性肝癌小鼠模型的方法，该方法建立的模型能满足研究原发性肝癌发生发展及转移的机制、同时也适用于抗肿瘤药物开发、肝癌的实验性治疗及诊断研究的需要。既能真实地模拟原发性肝癌的生物学特性又简单、迅速、成功率高且价格低廉可以大批制作。实现上述目的的技术解决方案如下小鼠原发性肝癌模型建立的方法为选用HepS细胞株，该细胞株是小鼠肝癌细胞株，在ICR小鼠腹腔内培养，制成HepS腹水癌小鼠，保种传代简单方便；选用ICR小鼠作为模型动物，该小鼠是我国常用的实验动物品系，稳定性、一致性好，易于获得、繁殖，所需饲养空间小，饲养、管理费用非常便宜；HepS腹水癌小鼠的腹水内有大量HepS细胞，可供多次大量制作动物模型，保证了动物模型的一致性，同时由于该细胞已经适应ICR小鼠体内环境，同种移植，增加了细胞肝内移植的成功率；抽取腹水离心弃上清后加入预冷的Hank’s液吹打冲洗1000rpm离心后弃上清，重复以上过程2-3次，再加入预冷的Hank’s液吹匀后500rpm离心，红细胞留于上清，弃上清保留沉淀细胞，加入DMEM细胞培养基制成HepS细胞悬液，以此步骤除去腹水中HepS细胞以外的其他成分，减少未知成分对模型动物的影响；将ICR小鼠以戊巴比妥钠麻醉，固定后于小鼠剑突下分层剪开皮肤和腹膜，将小鼠肝左叶按压出切口，用微量注射器抽取1×107×5μL细胞悬液注射入小鼠肝脏；微量注射器拔出后立即以75％酒精棉签按压针孔至肝脏表面不再渗血，以此步骤杀死漏出的少量细胞，并可避免细胞悬液漏出肝脏；用α-氰基丙烯酸盐乙酯粘合剂封闭针孔，以防止HepS细胞渗出流入腹腔后造成的腹腔内广泛转移灶而导致肿瘤种植失败；以生理盐水冲洗肝脏表面，既能防止穿刺孔漏出的HepS细胞进入腹腔导致模型失败，又能湿润暴露的肝脏减少对小鼠的损伤，提高术后存活率。本专利技术的有益效果是，用此方法建立的肝癌模型具有以下特点(1)肿瘤位于肝脏，且以单发性为主；肿瘤生长与血供特征与人类原发性肝癌相似；出现血道转移(肝内及肺转移)和淋巴道转移；(2)肿瘤为肝癌组织，生物学特性稳定而均一，其病理形态与人的肝癌结节相似；(3)肿瘤形成周期短、肿瘤生长快、病程发展快、患体生存期短，肿瘤可控性好且生长环境符合真实机体情况；(4)操作安全简单，操作所致死亡率低，动物模型稳定性、重复性好、成功率高；(5)可大批制作且同步性好，适用于药物筛选及较大规模的实验性治疗；(5)模型动物廉价，易于饲养。故该模型是一种可以用于研究原发性肝癌发生发展机制、同时也适用于抗肿瘤药物开发、肝癌的实验性治疗及诊断研究的理想的原发性肝癌模型。四.附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术结果进一步说明。图1是模型小鼠手术后五十天断颈处死后打开腹腔的全照，剑突下肝左叶注射部位可见白色肿瘤结节。图2是模型小鼠腹腔近照，结节大小约为1.3cm×1.1cm，肿瘤境界不清，附近有附生的小结节。图3是模型小鼠全肝(左)与注射DMEM培养基的对照组小鼠全肝(右)对照图，可见模型小鼠肝脏明显肿大，符合原发性肝癌的临床表现。图4是模型小鼠肝左叶(左)与注射DMEM培养基的对照组小鼠肝左叶(右)对照图。图5是模型小鼠肝全肝(左)、脾脏(左)与注射DMEM培养基的对照组小鼠全肝(右)、脾脏(右)对照图。图6是模型小鼠肝脾脏(左)与注射DMEM培养基的对照组小鼠脾脏(右)对照图，可见模型小鼠脾脏明显肿大，符合原发性肝癌的临床表现。图7是模型小鼠全肝近照。图8是模型小鼠肝左叶肿瘤结节近照。图9是肿瘤侵入远离肿块的门管区的病理照片(40×)。图10是门管区的肿瘤细胞的病理照片(200×)。图11是肿瘤组织内血管的病理照片(50×)。图12是肿瘤坏死区的病理照片(200×)。图13是肝癌转移侵入颅骨的病理照片(100×)。图14是肝癌转移侵入胸廓的病理照片(100×)。图15是肝癌转移侵入胸膜下的病理照片(200×)。图16是肝癌转移侵入胰腺的病理照片(100×)。五.具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术做进一步说明。用注射器从HepS腹水癌小鼠的腹腔内抽取腹水2mL，置于离心管内，1000rpm离心，弃上清。加入5mL预冷的Hank’s液重悬、吹洗，再1000rpm离心5分钟，弃上清。用预冷的Hank’s溶液以同样方法重复洗一遍。在沉淀内加入5mL预冷的Han本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鼠原发性肝癌模型的建立方法，其特征在于：选用ＨｅｐＳ细胞株，选用的ＩＣＲ小鼠是我国常用的实验动物品系，将ＨｅｐＳ细胞保种培养在ＩＣＲ小鼠腹腔中，抽取腹水，分离细胞并制成细胞悬液，用微量注射器抽取细胞悬液注射入小鼠肝脏，用７５％酒精棉签按压针孔至肝脏表面不再渗血，用α－氰基丙烯酸盐乙酯粘合剂封闭针孔，以生理盐水冲洗肝脏表面。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张煜，徐涵文，沈萍萍，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]