一种分离纯化小胶质细胞的方法技术

本发明专利技术属于肿瘤基础研究领域，涉及一种胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞的方法。本发明专利技术的方法包括将肿瘤组织用机械法联合酶消化法制成细胞悬液；密度梯度离心法，富集筛选出较高纯度的CD11b+的小胶质细胞，然后用CD11b+磁珠进一步分选获得高纯度的小胶质细胞；其中，Percoll分离液由70%的Percoll、30%的Percoll和HBSS组成。本发明专利技术优化的percoll密度梯度离心法富集小胶质细胞的纯度可达95%以上，且免疫荧光和吞噬实验等也证实其具有良好的功能；本发明专利技术的方法具有操作简便易行、成本较低、质量稳定等优点，为进一步研究脑胶质瘤中小胶质细胞的免疫功能及在肿瘤的免疫逃逸中的作用研究提供了基础。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于肿瘤基础研究领域，涉及一种胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞的方法。本专利技术的方法包括将肿瘤组织用机械法联合酶消化法制成细胞悬液；密度梯度离心法，富集筛选出较高纯度的CD11b+的小胶质细胞，然后用CD11b+磁珠进一步分选获得高纯度的小胶质细胞；其中，Percoll分离液由70%的Percoll、30%的Percoll和HBSS组成。本专利技术优化的percoll密度梯度离心法富集小胶质细胞的纯度可达95%以上，且免疫荧光和吞噬实验等也证实其具有良好的功能；本专利技术的方法具有操作简便易行、成本较低、质量稳定等优点，为进一步研究脑胶质瘤中小胶质细胞的免疫功能及在肿瘤的免疫逃逸中的作用研究提供了基础。【专利说明】
本专利技术属于肿瘤基础研究领域，涉及，尤其涉及从离体的新鲜胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞的方法；该方法结合Percoll密度梯度离心法与磁珠分选法，通过免疫磁珠标记CDllb从新鲜胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞，并在体外培养扩增，为小胶质细胞与肿瘤免疫逃逸的关系研究提供基础。
技术介绍
现有技术公开了目前脑胶质瘤是发病率最高的原发性颅内肿瘤，其具有生存期短、复发率及死亡率高等特点。有统计显示,脑肿瘤是实体瘤患儿死亡的首要疾病,胶质瘤占儿童肿瘤构成比的1/5左右，成人胶质瘤占原发性颅内肿瘤的50%~60%。尽管近年来的综合治疗(包括手术、放疗、化疗)取得了进步，但胶质母细胞瘤2年的生存率为27.2%，5年仅为9.8%。由于免疫治疗具有抗肿瘤的精确性和可持续性等可能的潜在优势，故近年来对胶质瘤免疫逃逸机制及免疫治疗的研究成为胶质瘤应用基础研究中发展最为迅速的领域之一。小 胶质细胞(Microglia)是胶质瘤组织中浸润的主要免疫细胞。有研究采用流式细胞术发现胶质瘤组织中约1/3的细胞表达小胶质细胞的标记(CDllb/c)，其远远超过了胶质瘤组织中其他免疫细胞的数量。所述小胶质细胞与中枢神经系统的先天性和获得性免疫反应相关，在生理条件下，小胶质细胞呈分枝状并一直监视其周围的微环境，一旦被激活，其将对中枢神经系统的损伤做出反应并分泌炎性因子和神经营养因子，吞噬受损的细胞及碎片，乃至呈递抗原。基于小胶质细胞在中枢神经系统病理生理中的重要作用，最近有若干研究关注于人小胶质细胞的分离，以便探索其在多种中枢神经系统疾病中的作用；然而，目前大多数的分离方法都花费相当多的时间用生长因子(如M-CSF、GM-CSF)刺激培养细胞；其中，Gibbons等认为，若要获得理想的纯度和质量，势必要从分子生物学的角度分析小胶质细胞的表型(Int J Biochem Cell Biol，2010，42:844 - 856) ;Dick 和 Hussain 分别于 1997 年和2006年介绍了从新鲜组织中分离小胶质细胞的方法，但是并未涉及小胶质细胞的分离纯度(AIDS，1997，11:1699 - 1708 ；Neuro Oncol, 2006a, 8:261 - 279) ;2010 年，Adam Wu 采用Percoll密度梯度离心法分离人脑胶质瘤组织中的小胶质细胞(Neuro Oncol, 2010, 12(11):1113-1125)。新近，荷兰科学家Marta等提供了从尸体脑组织中分选小胶质细胞的途径，并且也采用了 percoll密度梯度离心联合磁珠分选的办法(GLIA，2012，60:96-111),但其中采用的机械剪切组织制备细胞悬液，仍存在细胞得率低及损伤较大的缺点，虽然Cardona等建立了从鼠脑组织中提取小胶质细胞的方法，并且达到了近100%的纯度(NatProtoc，2006，1:1947 - 1951 )，但目前为止，如何高效的从人的新鲜胶质瘤标本中获得高纯度的小胶质细胞仍然存在较大困难。迄今为止，尚未见有关结合Percoll密度梯度离心法与磁珠分选法，通过免疫磁珠标记CDllb有效地从新鲜胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞，并在体外培养扩增的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服现有技术的缺陷，提供，尤其是从离体的新鲜胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞的方法；该方法结合Percoll密度梯度离心法与磁珠分选法，通过免疫磁珠标记CDllb有效地从离体的新鲜胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞，并在体外培养扩增，为小胶质细胞与肿瘤免疫逃逸关系的研究提供重要的基础。本专利技术中，首先采用机械剪切联合酶消化的方法提高细胞得率及减小细胞损伤，具有操作简便、效果显著的特点。本专利技术中，结合Percoll密度梯度离心法与磁珠分选法，从离体的新鲜胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞，其中的Percoll为包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒；其渗透压低? 20mosm/kg H20),粘度小,可形成高达1.3g/ml密度,采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200~1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离效果；由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度较稳定；此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，可用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，以及将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离；本专利技术中，采用免疫磁珠分选系统(Magnetic Cell Sorting, MACS)用于细胞分离，该技术的核心是在磁珠表面包被抗体，直接与靶细胞的相应抗原分子或间接与事先结合在靶细胞表面的抗体进行抗原抗体反应，在外加磁场中，结合了磁珠的细胞会与其他未被结合的细胞分离，当超强顺磁性的磁珠脱离磁场后会立即消失磁性，此时可提取或去除所标记的细胞，从而达到阳性或阴性分选的目的；所述MACS具有孵育时间短、操作过程快、不影响细胞在流式检测中 的散射特性与细胞的功能和活性等优点，而且，磁珠会在细胞培养的过程中生物降解，而无需再进行专门的去除。本专利技术的分离纯化小胶质细胞的方法，包括如下步骤:第一步，结合物理分离和酶的消化作用，将胶质瘤标本制成单细胞悬液，比单一方式能更多的获得保持细胞活性的细胞；第二步，通过不同浓度Percoll溶液分离，富集小胶质细胞，并将其与髓磷脂及红细胞碎片等分开；第三步，利用免疫磁珠分选CDllb阳性的细胞，提高小胶质细胞的分离纯度；本专利技术方法中，采用流式细胞术检验每一步骤所得细胞的纯度，以活细胞中CDllb+细胞的比例表示小胶质细胞的纯度:其中第一步所得细胞中有30%的CDllb+的小胶质细胞，第二步所得细胞中有80%左右的CDllb+的小胶质细胞，第三步则收获纯度高达95%以上的⑶IIb+的小胶质细胞；本专利技术方法中，还采用免疫荧光方法，定性直观地观察最后获得的细胞中小胶质细胞的另一经典标记Iba-1染色的情况，结果与流式细胞术的一致。更具体的，本专利技术的，其特征在于，其包括步骤:(I)将离体的新鲜脑胶质瘤组织用机械剪切结合酶消化的方法制成单细胞悬液，取少量细胞悬液用CDllb流式抗体检测小胶质细胞的纯度；(2)按优化后的方法配置不同密度Percoll分离液(70%和30%)；(3)将制成的单细胞悬液离心后去上清，细胞用70%perCO114ml重悬成单细胞悬液，加入15ml的离心管,然后依序加入30%percoll液及HBSS层；500g, 30min, 4°C，低加减速度进行离心；取少量细胞悬液用CDllb流式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离纯化小胶质细胞的方法，其特征在于，其包括步骤：步骤一，结合物理分离和酶的消化作用，将离体的新鲜的胶质瘤组织标本制成单细胞悬液；步骤二，采用不同浓度Percoll溶液分离、富集小胶质细胞，并将其与髓磷脂及红细胞碎片分开；步骤三，利用免疫磁珠分选CD11b阳性的细胞，提高小胶质细胞的分离纯度。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：毛颖，叶红星，姚瑜，岳琪，莫链杰，张新，周良辅，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：