本发明专利技术公开了一种提取纯化人体脱落细胞DNA的方法。该方法包括以下步骤：1)预处理：将人体脱落细胞与预处理裂解液接触，去除生物细胞所粘附的固体物质，得到粗裂解液；2)核酸吸附：将步骤1)得到的粗裂解液与裂解结合液以及磁珠悬浮液混合，形成含有磁性纳米微球-DNA的复合体的溶液体系，收集所述溶液体系中的磁性纳米微球-DNA的复合体；3)洗涤：将步骤2)得到的磁性纳米微球-DNA的复合体依次用洗涤液I、洗涤液II洗涤，然后用洗脱液溶出DNA。本发明专利技术提供的方法提取DNA的效率可达90％，提取的DNA可应用于STR复合扩增、DNA测序、DNA定量等下游分析操作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种提取纯化DNA的方法。
技术介绍
DNA分离纯化是分子生物学实验中非常重要的操作，核酸的质量直接关系到后续操作能否顺利进行。生物学、法医学和基因组学的发展，强化了对从各种生物检材中获得核酸的复杂方法的需求。例如，脱氧核糖核酸提供了广泛的关于遗传起源和遗传多态性信息。 这些信息可用于法医遗传学鉴定实践。目前所存在的各种核酸纯化方法皆可分成以下两大类液相纯化和固相纯化。在液相纯化中，核酸维持为液体状态，而杂质通过沉淀、离心被除去或者核酸被沉淀出来，而杂质被保留；在固相纯化中，核酸被结合到固相载体上，而杂质被选择性洗脱。例如，采用液相纯化来分离的DNA保留在液相中，而杂质被通过诸如沉淀和/或离心之类的方法除去。在固相纯化中DNA结合到固相载体上，而杂质如RNA、蛋白质和磷脂等被选择性洗脱。在DNA 纯化中，如果起始材料包括细胞，液相方法和固相方法都需要细胞或病毒共破裂，或裂解步骤。破裂或裂解步骤产生与污染物如RNA、脂质、碳水化合物、蛋白质等混合的DNA。这种混合物还含有降解DNA的必须被除去和/或灭活以不感染产生基本上未降解的DNA的DNA酶。 两个纯化大类以前都利用常规的方法，需要繁琐的步骤，且通常用到有害的试剂，现在也出现了更快速的提取方法，如Chelex-100法，仅需要较少的步骤，且通常较少的有害试剂。Chelex-100法一种快速液相DNA纯化方法，Chelex-100是一种化学整合树脂， 由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力.能结合许多可能影响一步分析的其他外源物质。通过离心除去Chelex-100颗粒，使这些与Chelex-100结合的物质与DNA分离，防止结合到Chelex中的抑制剂或杂质带到PCR 反应中，影响下一步的DNA分析，并通过结合金属离子，防止DNA降解。利用螯合剂去除生物样本中金属杂质而达到纯化的目的。该法首先用去离子水洗涤生物样本，加入螯合树脂的悬浮液56°C孵育一定时间，100°C孵育8分钟，然后通过离心去除杂质。该方法简单、快速 (仅涉及到两种试剂的使用)。但该法提取得到的DNA纯度不够，不能满足微量DNA生物样本DNA提取纯化的要求。固相提取方法近年来发展迅速，在核酸提取领域占有非常重要的地位。这类方法一般需要四个主要步骤裂解细胞使细胞膜、核膜DNA破裂以释放DNA ；释放的DNA与固相载体结合；杂质的洗涤；洗脱而得到纯化的DNA。对于固相DNA纯化，已使用了多种固相载体，如二氧化硅微球、薄膜过滤器、金属氧化物、胶乳沉淀、硅藻土、玻璃粉等。当核酸存在于在高浓度离液盐以及低的PH溶液中时，能够吸附到硅类介质表面，并在低盐高pH溶液中洗脱下来，从而达到提取纯化目的。Vogelstein直接使用玻璃粉从琼脂糖凝胶中提取到DNA， 而Marko使用玻璃粉成功提纯质粒DNA。Boom等对该方法加以改进，用二氧化硅和硅藻土为固相吸附剂，用来提取纯化人血清或尿液中的微量病原体基因组DNA。该方法需要六步离心、五种试剂从全血种纯化DNA。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提取纯化DNA的方法。本专利技术提供的提取纯化DNA的方法，包括以下步骤1)预处理将生物样品与预处理裂解液接触，去除生物细胞所粘附的固体物质， 得到粗裂解液；2)核酸吸附将步骤1)得到的粗裂解液与裂解结合液以及磁珠悬浮液混合，DNA 将与磁珠结合，形成了含有磁性纳米微球-DNA的复合体的溶液体系，收集所述溶液体系中的磁性纳米微球-DNA的复合体；3)洗涤将步骤2)得到的磁性纳米微球-DNA的复合体依次用洗涤液I、洗涤液II 洗涤，然后用洗脱液溶出DNA，得到纯化的DNA。上述步骤1)中，所述生物样品是血液、血斑、组织、阴道拭子、口腔拭子、唾液斑、 汗液斑或脱落细胞时，所述预处理裂解液的PH为7. 4-8. 5，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质IO-IOOmM缓冲盐，0. 5-5g/100ml的表面活性剂，I-IOOmM的螯合剂和50_150mM的可溶性盐，0. 2-4mg/ml的蛋白酶K。精斑和毛发中DNA的提取，需在预处理裂解液中加入DTT (二硫苏糖醇)，上述步骤 1)中，所述生物样品是精液、精斑或毛发时，所述预处理裂解液的PH为7. 4-8. 5，溶剂是水， 溶质是如下终浓度的物质10-100mM缓冲盐，0. 5-5g/100ml的表面活性剂，I-IOOmM的螯合剂，50-150mM的可溶性盐，0. 2-4mg/ml的蛋白酶K和0. 025-0. 05M的二硫苏糖醇。上述预处理裂解液中，缓冲盐的浓度优选为20_80mM，表面活性剂的浓度优选为 0. 5-4g/100ml，螯合剂的浓度优选为20_80mM，可溶性盐的浓度优选为50_130mM，更优选为 80-100mM ；蛋白酶K的浓度优选为0. 2_2mg/ml，更优选浓度为0. 2-lmg/ml。所述预处理裂解液中的表面活性剂为阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂，优选是阴离子表面活性剂，所述阴离子表面活性剂为十二烷基磺酸钠或十二烷基肌氨酸钠。所述预处理裂解液还包括一种可溶性盐溶液，DNA从细胞核中释放并与组蛋白分离后，需要提高DNA在溶液中的溶解度。DNA在一定浓度氯化钠溶液中的溶解度很高，Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这使DNA在溶液中呈溶解状态并维持DNA在溶液中的稳定性。所以在某些实施例中，可以使用NaCl等可溶性盐。蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的一般降解。此酶经纯化去除了 RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛。各种生物样品，如血液、血斑、精液、精斑、毛发、组织、阴道拭子、口腔拭子、唾液斑、汗液斑或脱落细胞等首先要经过预处理裂解液浸泡，并在50-65°C的温度下孵育 0. 5h-4h时间后，方可进行后续提取操作。孵育的温度可优选为56°C。通过预处理裂解液对生物样本的预处理，一是能够使载体上黏附的细胞(如血白细胞、精子细胞、上皮细胞等)和DNA与载体分离或与组织脱离，游离在预处理裂解液中；二是裂解细胞，使DNA和蛋白质、磷脂等污染物释放至消化液中，通过离心等方法去除载体后即形成粗裂解液并完成样本预处理。所述步骤1)预处理中，本专利技术中的生物样品如血斑、唾液斑等一般取3*3mm为宜， 这类样本比较小，预处理裂解液可在100-200ul范围内变化；对于体积较大样本，预处理裂解液的量一般以完全覆盖住生物样本为宜，但最多不能超过300ul。预处理后形成的粗裂解液中包含DNA及蛋白质、细胞碎片、磷脂等细胞污染物。为了更充分的裂解细胞，最大程度的使DNA从细胞中释放出来，并使释放出来的DNA与磁性微球结合以达到分离纯化的目的，可以使用裂解结合液。所述步骤2)核酸吸附中，每ml磁珠悬浮液的组分如下直径为50-1200nm的纳米级硅包被磁性微球50-100mg，其余为水。每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球优选是 50mgo所述裂解结合液的pH本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．提取纯化ＤＮＡ的方法，包括以下步骤：１）预处理：用预处理裂解液裂解生物样品，得到粗裂解液，所述生物样品是人体脱落细胞；其中，预处理裂解液：ｐＨ为７．４，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，０．５ｇ／１００ｍｌ的十二烷基磺酸钠ＳＤＳ，１ｍＭ的ＥＤＴＡ和５０ｍＭ的ＮａＣｌ，０．５ｍｇ／ｍｌ的蛋白酶Ｋ；２）核酸吸附：将步骤１）得到的粗裂解液与裂解结合液以及磁珠悬浮液混合，形成含有磁性纳米微球－ＤＮＡ的复合体的溶液体系，收集所述溶液体系中的磁性纳米微球－ＤＮＡ的复合体；其中，裂解结合液：ｐＨ为６．４，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：５０ｍＭ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，３Ｍ的异硫氰酸胍，１％（体积百分比）的Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，０．５ｇ／１００ｍｌ的３－（３－胆胺丙基）－二甲氨基－１－丙磺酸，１０ｍＭ的ＥＤＴＡ以及１５％（体积百分含量）的乙醇；磁珠悬浮液：每ｍｌ磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球为５０ｍｇ，其余为水，纳米级硅包被磁性微球的直径是６０ｎｍ；３）洗涤：将步骤２）得到的磁性纳米微球－ＤＮＡ的复合体依次用洗涤液Ｉ、洗涤液ＩＩ洗涤，然后用洗脱液溶出ＤＮＡ，得到纯化的ＤＮＡ；其中，洗涤液Ｉ：溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：４Ｍ的盐酸胍，２５％（体积百分含量）的乙醇和１０ｍＭ的ＥＤＴＡ；洗涤液ＩＩ：７５％（体积百分含量）乙醇水溶液；洗脱液：是ＴＥ溶液，所述ＴＥ溶液的ｐＨ为８．０，溶剂是水，溶质是１０ｍＭ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ的ＥＤＴＡ。...
【技术特征摘要】
1.提取纯化DNA的方法，包括以下步骤1)预处理用预处理裂解液裂解生物样品，得到粗裂解液，所述生物样品是人体脱落细胞；其中，预处理裂解液pH为7. 4，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质10mM Tris-HCl, 0. 5g/100ml的十二烧基磺酸钠SDS，ImM的EDTA和50mM的NaCl，0. 5mg/ml的蛋白酶K ；2)核酸吸附将步骤1)得到的粗裂解液与裂解结合液以及磁珠悬浮液混合，形成含有磁性纳米微球-DNA的复合体的溶液体系，收集所述溶液体系中的磁性纳米微球-DNA的复合体；其中，裂解结合液pH为6. 4，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质50mM的Tris-HCl，3M的异硫氰酸胍，(体积百分比)的Triton X-10...
【专利技术属性】
技术研发人员：周云彪，赵兴春，叶健，
申请(专利权)人：公安部物证鉴定中心，
类型：发明
国别省市：11
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