本发明专利技术涉及分子标记技术，具体的说是一种快速提取红松胚基因组DNA的方法。将研磨后红松胚投加于氯仿中，于60-65℃水浴10-15min，待用；将上述水浴处理后红松胚加入CTAB提取缓冲液中，于60-65℃水浴10-15min，而后以10000-12000r·min-1离心2-5min，取上清液待用；所得上清液中加入与上清液等体积的氯仿-异戊醇，而后在10000-12000r·min-1离心2-5min，取上清液待用；所得上清液中加入上清液2/3体积的异丙醇，混匀后于-20-40℃下静止5-15min，而后以10000-12000r·min-1离心1-5min，收集沉淀，洗涤后，即得到松胚基因组DNA。本发明专利技术与传统的CTAB法相比，提取效果比较好，时间短，容易操作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子标记技术，具体的说是一种快速提取红松胚基因组DNA的方法。
技术介绍
近年来，分子标记技术已经被广泛用于红松遗传多样性、交配系统分析、亲本鉴定、遗传图谱构建及标记辅助育种等研究领域。该技术可用少量的DNA对许多样品进行快速的分析。但采用该技术开展科研工作的前提是首先建立起大规模快速提取个体DNA的方法。而基因组DNA的质量好坏直接影响分子生物学实验的成败。例如，在PCR过程中多糖、 色素、脂质和多酚等物质都会严重影响DNA聚合酶的活性，干扰引物与模板的结合，导致实验失败。以往大多数实验以红松的叶片为材料，采用CTAB法和SDS法，这些方法操作步骤繁琐，耗时长，所用药品多，花费大。为了缩短时间，减少工作量，很多人开始探索直接用种子提取DNA的方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于，提供一种快速提取红松胚基因组DNA的方法。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为一种快速提取红松胚基因组DNA的方法按如下方法操作，1)将研磨后红松胚投加于氯仿中，于60_65°C水浴10-15min，待用；即每一个红松胚研磨后加入200-500 μ L氯仿中；2)将上述水浴处理后红松胚加入CTAB提取缓冲液中，于60-65°C水浴10-15min， 而后以10000-12000r · rniiT1离心2_5min，取上清液待用；3)将步骤2)所得上清液中加入与上清液等体积的氯仿-异戊醇，而后在 10000-12000r · mirr1 离心 2_5min，取上清液待用；4)将步骤幻所得上清液中加入上清液2/3体积的异丙醇，混勻后于-20--40°C下静止5-lOmin，而后以10000_12000r · mirT1离心l-5min，收集沉淀，洗涤后，即得到红松胚基因组DNA。所述步骤1)中研磨后红松胚为将红松胚加入液氮中研磨成粉末。所述步骤1)和 2)中水浴时需振荡2-3次。所述步骤幻中氯仿-异戊醇混合比例为按体积比为M 1混合。所述步骤4)中上清液与异丙醇混合后上下倒置混合均勻。所述步骤幻中离心得到沉淀用70 %乙醇洗沉淀2次，而后于室温干燥，将干燥后所得DNA沉淀溶于50 μ LTE中溶解保存。本专利技术所具有的优点本专利技术与传统的CTAB法相比，提取效果比较好，时间短，容易操作。由于本专利技术提取方法先加入氯仿除去DNA酶、多糖等杂质，后加入CTAB提取液的做法，使得DNA降解少， 完整性好。另外在沉淀过程中，将温度由室温改为冰箱-20°C内，也可以防止DNA在沉淀过程中不被降解。另外缩短离心时间，离心速度(统的方法为12000r · mirT1，IOmin,降为10000r · HiirT1，Imin)，也可以减少多糖等杂质与DNA —起被沉淀。 附图说明图1为本专利技术实施例提供的图1提取红松胚基因组DNA电泳图(未加RNAse处理)。图2为常规CTAB法提取红松胚基因组DNA电泳图(未加RNAse处理)。具体实施例方式实施例1提取红松胚基因组DNA的方法1)取一个红松胚置于2mL离心管中，加入液氮充分研磨研磨成呈现白色粉末，加入500 μ L氯仿，于65°C下水浴lOmin，其间轻轻振荡3次，待用。2)水浴后将其加入500 μ LCTAB提取缓冲液中，于65°C下水浴lOmin，其间轻轻振荡3次，而后以12000r · HiirT1离心2min，收集上清液转至新管中。CTAB提取缓冲液为每升缓冲液中加入其体积百分比2 %的CTAB，即为CTAB 提取缓冲液，其中提取缓冲液为 IOOmmol · L^Tris-HCl (ρΗ8· 0)，1. 4mol · L^1NaCl, 20mmol · L-1EDTA, 20mmol · L-1Na2S2O503)将上述收集上清液中加入上清液等体积的体积比为M 1的氯仿-异戊醇混合液，而后以12000r · HiirT1离心2min，收集上清液转至新管中。4)将上述收集上清液中加入上清液2/3体积的预冷到0-4°C的异丙醇，轻轻上下倒置，而后置于_20°C的冰箱内静止5min，再以IOOOOr · mirT1离心lmin，离心后小心倒掉上清液，用纸吸取管壁处多余的溶液，保留DNA沉淀于管底。5)将上述沉淀用70 %乙醇500 μ L洗涤沉淀，振荡起沉淀数秒钟，以5000r · mirT1 离心aiiin去上清液。重复洗涤沉淀1次。室温干燥。在见到无色胶状物附在管壁时，加入 50 μ LTE溶解沉淀的DNA，保存(参见图1)。一般来讲，RNA不影响DNA的分析，如果需要高质量的DNA，则可以进行纯化。加入 RNase 2ul，将 RNA 除去。实施例2与实施例1不同之处在于1)取一个红松胚置于2mL离心管中，加入液氮充分研磨研磨成呈现白色粉末，加入400 μ L氯仿，于65°C下水浴15min，其间轻轻振荡3次，待用。2)水浴后将其加入500 μ LCTAB提取缓冲液中，于65°C下水浴lOmin，其间轻轻振荡3次，而后以12000r · mirT1离心2min，收集上清液转至新管中。CTAB提取缓冲液为每升缓冲液中加入其体积百分比2%的CTAB，即为CTAB提取缓冲液，其中提取缓冲液为 IOOmmol 'L-1Tris-HCl (ρΗ8. 0)，1. 4mol ·I^NaCl，20mmol 'L-1EDTA, 20mmol · L-1Ne^2O503)将上述收集上清液中加入上清液等体积的体积比为M 1的氯仿-异戊醇混合液，而后以12000r · mirT1离心2min，收集上清液转至新管中。4)将上述收集上清液中加入上清液2/3体积的预冷到0-4°C的异丙醇，轻轻上下倒置，而后置于_20°C的冰箱内静止5min，再以IOOOOr · mirT1离心lmin，离心后小心倒掉上清液，用纸吸取管壁处多余的溶液，保留DNA沉淀于管底。5)将上述沉淀用70%乙醇500 μ L洗涤沉淀，振荡起沉淀数秒钟，以5000r · mirT1 离心aiiin去上清液。重复洗涤沉淀1次。室温干燥。在见到无色胶状物附在管壁时，加入 50 μ LTE溶解沉淀的DNA，保存。按照本实施方式可以可使反应均勻且充分，同时提高植物DNA的提取质量。实施例3与实施例1不同之处在于1)取一个红松胚置于2mL离心管中，加入液氮充分研磨研磨成呈现白色粉末，加入400 μ L氯仿，于65°C下水浴lOmin，其间轻轻振荡3次，待用。2)水浴后将其加入500 μ LCTAB提取缓冲液中，于65°C下水浴15min，其间轻轻振荡3次，而后以12000r · mirT1离心5min，收集上清液转至新管中。CTAB提取缓冲液为每升缓冲液中加入其体积百分比2%的CTAB，即为CTAB提取缓冲液，其中提取缓冲液为 IOOmmol 'L-1Tris-HCl (ρΗ8. 0)，1. 4mol ·I^NaCl，20mmol 'L-1EDTA, 20mmol · L-1Ne^2O503)将上述收集上清液中加入上清液等体积的体积比为M 1的氯仿-异戊醇混合液，而后以12000r · mirT1离心2min，收集上清液转至新管中。4)将上述收集上清液中加入上清液2/3体积的预冷到0-4°C的异丙醇，轻轻上下倒置，而后置于_20°本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种快速提取红松胚基因组ＤＮＡ的方法，其特征在于：按如下方法操作，１）将研磨后红松胚投加于氯仿中，于６０－６５℃水浴１０－１５ｍｉｎ，待用；２）将上述水浴处理后红松胚加入ＣＴＡＢ提取缓冲液中，于６０－６５℃水浴１０－１５ｍｉｎ，而后以１００００－１２０００ｒ·ｍｉｎ－１离心２－５ｍｉｎ，取上清液待用；３）将步骤２）所得上清液中加入与上清液等体积的氯仿－异戊醇，而后在１００００－１２０００ｒ·ｍｉｎ－１离心２－５ｍｉｎ，取上清液待用；４）将步骤３）所得上清液中加入上清液２／３体积的异丙醇，混匀后于－２０－－４０℃下静止５－１０ｍｉｎ，而后以１００００－１２０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１－５ｍｉｎ，收集沉淀，洗涤后，即得到红松胚基因组ＤＮＡ。
【技术特征摘要】
1.一种快速提取红松胚基因组DNA的方法，其特征在于按如下方法操作，1)将研磨后红松胚投加于氯仿中，于60-65°C水浴10-15min，待用；2)将上述水浴处理后红松胚加入CTAB提取缓冲液中，于60-65°C水浴10-15min，而后以10000-12000r · rniiT1离心2_5min，取上清液待用；3)将步骤幻所得上清液中加入与上清液等体积的氯仿-异戊醇，而后在 10000-12000r · mirr1 离心 2_5min，取上清液待用；4)将步骤幻所得上清液中加入上清液2/3体积的异丙醇，混勻后于-20--40°C下静止 5-lOmin，而后以10000_12000r · mirT1离心l-5min，收集沉淀，洗涤后，即得到红松胚基因组 DNA。2...
【专利技术属性】
技术研发人员：隋心，韩士杰，冯富娟，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：89
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