一种核酸扩增方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种核酸扩增方法及其试剂盒。本发明专利技术利用限制性切刻酶进行双链DNA和/或单链DNA的扩增。除额外加入限制性切刻酶外不需要添加任何另外的试剂，也就不存在这些物质对后续TMA或NASBA反应的影响，因此可以避免额外添加限制性寡核苷酸造成的扩增效率降低、非特异产物增加的问题。本发明专利技术所述方法及试剂盒可以用于任何类型的DNA、样品中待检病毒DNA以及基因组DNA，不仅可以用于DNA混合样本的多重检测，还适用于DNA和RNA混合样本的多重检测，与其他相关技术结合，能广泛地应用于分子诊断、科学研究、防疫检测、法医鉴定等领域。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于生物
，公开了及其试剂盒。本专利技术利用限制性切刻酶进行双链DNA和/或单链DNA的扩增。除额外加入限制性切刻酶外不需要添加任何另外的试剂，也就不存在这些物质对后续TMA或NASBA反应的影响，因此可以避免额外添加限制性寡核苷酸造成的扩增效率降低、非特异产物增加的问题。本专利技术所述方法及试剂盒可以用于任何类型的DNA、样品中待检病毒DNA以及基因组DNA，不仅可以用于DNA混合样本的多重检测，还适用于DNA和RNA混合样本的多重检测，与其他相关技术结合，能广泛地应用于分子诊断、科学研究、防疫检测、法医鉴定等领域。【专利说明】
本专利技术属于生物
，尤其涉及。
技术介绍
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术是20世纪80年代分子生物学领域的一项革命性突破。经过几十年的改进，PCR方法已从定性发展为定量，能够在几个小时内从几个拷贝或单个细胞开始扩增到数十亿特异性的核酸片段。尽管PCR技术长期占据着核酸扩增技术的垄断地位，但后续研发的一系列等温(isothermal)核酸扩增技术正逐渐成为PCR技术的替代方法而被广泛应用。这些扩增技术应用不同的原理和方法，可在某一特定温度条件下(如37°C)，实现核酸(DNA或RNA)的扩增。国际国内已有的恒温扩增技术如:核酸序列扩增技术(Nucleic acidsequence based amplification, NASBA)、转录介导扩增技术(transcription-mediatedamplification, TMA)、链置换扩增技术(Strand Displacement Amplification, SDA)>滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification, RCA)、解链酶扩增技术(HelicaseDependant Amplification, HAD)、单引物等温扩增技术(Single primer isothermalamplification, SPIA)和切刻内切酶核酸恒温扩增(Nicking endonuclease mediatedamplification, NEMA)等等。其中，核酸序列扩增技术(NASBA)和转录介导扩增技术(TMA)是目前国际上最成熟的恒温扩增技术，在研究及临床检验领域被广泛应用。本专利技术方法与这两种技术紧密相关。NASBA和TMA两种核酸扩增方法都需要四种酶活性来完成:依赖RNA的DNA聚合酶活性、依赖DNA的DNA聚合酶活性、RNA酶H活性和RNA聚合酶活性。这些活性中的一些可以联合在一种酶中，所以通常只有2或3种酶是必需的。两种方法的区别在于所选择的逆转录酶不同，NASBA方法使用禽成肌细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶，而TMA方法选用莫洛尼属白血病病毒(M-MLV)逆转录酶。它们的扩增原理相似:目标序列在逆转录酶作用下，以引物为引导进行逆转录，逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后，合成带双链T7启动子序列的DNA，并在T7 RNA多聚酶作用下，转录出成千上万个目标RNA序列，这些RNA又可以作为模板进行下一个循环，整个反应是一个自催化过程。最后可通过一些方法(比如添加分子信标探针)检测扩增产物来定量或定性靶核酸。实际上，从样品中的单链RNA开始，一旦将所有的成分放在一起，并将混合物置于适当的温度以让酶都有活性，整个一系列事件就会发生，无需人为干预。勿庸置疑，TMA或NASBA技术扩增方法对于单链RNA的扩增特别有效。然而当对只以双链DNA的形式存在(环状或线性)的靶核酸实施TMA或NASBA的扩增方法时，必须将DNA转变成单链核酸，合成出RNA。在EP397269中描述了一种方法，双链DNA用限制性内切酶进行预处理，之后用加热分离步骤使其形成单链DNA。在该方法中使用第一引物Pl (启动子引物)，其3'部分含有与DNA双链中的一条3'末端准确互补的序列，以及5'末端含有可被RNA聚合酶(如T7)识别的启动子序列。其中第一引物的5'启动子序列可以作为用于从DNA链3'末端开始延伸反应的模板。因此，通过依赖DNA的DNA聚合酶可形成双链启动子，结果产生的复合物可以作为对于依赖DNA的RNA聚合酶的模板从而合成RNA的多重拷贝。随后的反应进程与普通的TMA或NASBA方法完全一致。其反应过程如图1。当DNA是单链时，限制性寡核苷酸(RP)或限制性引物含有与包括目标DNA的限制位点的区域互补的序列，将其和限制性内切酶一起添加，如图2。限制性寡核苷酸的功能可以合并入含有可被依赖DNA的RNA聚合酶识别的启动子序列的寡核苷酸内。bioMerieux公司采用该方法解决HBV的等温扩增(NASBA)问题,95%的检出率为242 WHO IU/mL，50%的检出率为35 WHO IU/mL。内切酶酶切变性使待测DNA变成单链进而形成所需RNA的设计打破了 NASBA或TMA不能扩增DNA的禁锢，无疑具有非凡的意义。但是也存在明显的缺点:1、该方法的使用前提是必需首先明确待测样本为单链还是双链DNA，从而采取不同的策略(是否添加RP)来进行。2、额外核苷酸序列(RP)的添加势必会对扩增反应体系产生不利影响，引物间非特异性结合的几率增大；酶切之后的产物势必会引起非特异性产物的增加等等。而引物间非特异性结合的几率增大和非特异性产物的增加都将导致整个体系的有效扩增效率降低。3、即便限制性寡核苷酸的功能可以合并入含有可被依赖DNA的RNA聚合酶识别的启动子序列的寡核苷酸内，但其经酶切后仍然会形成两条额外序列(这两条序列对整个扩增反应体系而言不是必需的)，仍无法避免非特异性产物增加的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的针对现有技术中额外添加RP造成的扩增效率降低、非特异产物增加的问题，提供一种扩增效率高、非特异产物少的切刻酶耦联转录介导的核酸扩增方法。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案:为在含有所选限制位点切割DNA的限制性切刻酶的反应混合物中进行转录扩增。本专利技术利用限制性切刻酶进行双链DNA和/或单链DNA的扩增。除额外加入限制性切刻酶外不需要添加任何另外的试剂(比如限制性寡核苷酸RP)，也就不存在这些物质对后续TMA或NASBA反应的影响，因此可以避免额外添加RP造成的扩增效率降低、非特异产物增加的问题。进一步的，该方法从存在于样品中的DNA开始，其具体包括以下步骤:A、在扩增缓冲液中温育待测样品，该温育体系中含有:一或多种能够在所选限制位点切割DNA的限制性切刻酶，该限制性切刻酶在该DNA的一条链上形成特定的3'末端；启动子引物,该启动子引物的5'区域包含被依赖DNA的RNA聚合酶所识别的启动子序列且其3'区域与该DNA链的特定的3'末端反向互补；第二或反向引物，其具有与启动子引物相反的极性且含有目标序列的5'末端；B、将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行限制性切刻酶的消化；C、将样品以足以失活限制性切刻酶和/或导致双链的单链化的温度和时间进行加热处理；D、向样品中加入下列试剂，具有依赖RNA的DNA聚合酶活性的酶具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶具有RNas本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸扩增方法，其特征在于，该方法从存在于样品中的DNA开始，其具体包括以下步骤：A、在扩增缓冲液中温育待测样品，该温育体系中含有：一或多种能够在所选限制位点切割DNA的限制性切刻酶，该限制性切刻酶在该DNA的一条链上形成特定的3`末端；启动子引物，该启动子引物的5`区域包含被依赖DNA的RNA聚合酶所识别的启动子序列且其3`区域与该DNA链特定的3`末端反向互补；第二或反向引物，其具有与启动子引物相反的极性且含有目标序列的5`末端；B、将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行限制性切刻酶的消化；C、将样品以足以失活限制性切刻酶和/或导致双链的单链化的温度和时间进行加热处理；D、向样品中加入下列试剂，具有依赖RNA的DNA聚合酶活性的酶具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶具有RNaseH活性的酶具有RNA聚合酶活性的酶F、将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行扩增。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周裕程，杨文秀，万强，
申请(专利权)人：思洛生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：