【技术实现步骤摘要】
—种真核表达时酶切回收的方法
本专利技术涉及一种生化的实验方法,具体来说,一种真核表达时酶切回收PCDNA3.1 (-)的方法。
技术介绍
]血管内皮生长因子C(VEGF-C)属VEGF/PDGF家族成员,其受体为VEGFR -2,VEGFR -3。VEGF通过VEGFR -2调节血管和淋巴管的增生,而VEGFR-3表达则局限于淋巴管内皮,VEGF -C为VEGFR-2的结合,产生生物学效应的所需浓度远高于VEGFR -C,因此,VEGFR -3是淋巴管增生特异性调节因子,用VEGF -C转基因鼠实验证实,VEGF -C的高表达可以选择性地引起淋巴管增生,经研究,VEGF -C表达与肿瘤淋巴管增生和转移的关系是VEGF -C高表达可促进肿瘤的淋巴转移,其机理是VEGF -C促进了肿瘤周围及间质的淋巴管生长以及肿瘤组织中淋巴管增生。为进一步研究VEGF -C在淋巴管增生中的作用及其机制,我们构建了携带人VEGF -C cDNA的基因片段的真核表达载体,研究了它在真核细胞内的表达,为探讨VEGF -C与淋巴管增生的关系,VEGF -C基因用于治疗淋巴水肿和某些癌肿的可行性提供实验依据。
技术实现思路
为克服上述技术问题,我们提出了以下技术方案: 一种真核表达时酶切回收pc DNA3.1 (-)的方法,与目的基因连接并鉴定阳性,重温质粒,应用EcoR I和BamH I对pc DNA3.1 (-)进行双酶切反应,反应体系为50 μ 1:质粒 20 μ 1,EcoR 1、BamH 各 I I μ 1,IOXk Buffer 5μ I 加水至 50 μ I。 ...
【技术保护点】
一种真核表达时酶切回收的方法,其特征在于,与目的基因连接并鉴定阳性,?重温质粒,?应用EcoR?I?和BamH?I?对pc?DNA3.1(?)进行双酶切反应,?反应体系为50μl:质粒20μl?,?EcoR?I?、BamH?各I?1μl,?10×k?Buffer?5μl?加水至50μl;37℃水浴酶切反应2.5μl,?65℃水浴灭活30min,?取10μl?反应产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定;连接体系为10μl?,?目的DNA?片段1μl,?pcDNA?3.1(?)双酶切回收片段1μl?,?T4?连接酶1μl?,?10?×Buffer?1μl?,?加dH2O?至10μl;反应条件:16?℃过夜,?将连接后的pcDNA3.1(?)转化至DH5α感受态细胞200μl?中铺于LA?平板,?37℃孵育16h;随机挑取LA?平板上几个单菌落,?分别接种于5ml?LA?培养液,?37℃180r/min?震荡培养过夜,?按质粒提取说明提取质粒,?加入EcoR?I?和BamH?I?行双酶切反应;酶切体系:质粒20μl,?EcoR?I?、BamH?I?各1μl?,?10×k?Buffer?5μl,?加dH2O ...
【技术特征摘要】
1.一种真核表达时酶切回收的方法,其特征在于,与目的基因连接并鉴定阳性,重温质粒,应用EcoR I和BamH I对pc DNA3.1 (-)进行双酶切反应,反应体系为50 μ 1:质粒 20 μ I,EcoR 1、BamH 各 I I μ 1,IOXk Buffer 5μ I 加水至 50 μ I ;37°C 水浴酶切反应2.5 μ 1,65°C水浴灭活30min,取10 μ I反应产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定;连接体系为10 μ I,目的DNA片段Ιμ?,pcDNA 3.1 (-)双酶切回收片段I μ I,Τ4连接酶I μ I,10XBuffer I μ I,加dH20至10...
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