一种复方丹参浸膏中低聚三糖的分离纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种复方丹参浸膏中低聚三糖的分离纯化方法，该方法采用固相萃取法，对复方丹参浸膏中的糖类成分进行分离纯化，先得到复方丹参浸膏总糖提取物，然后采用凝胶色谱法，对复方丹参浸膏总糖提取物中的低聚糖成分实现了很好的分离，得到了一个低聚三糖成分：α-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-呋喃果糖-(1→1)-α-D-吡喃半乳糖。

【技术实现步骤摘要】
一种复方丹参浸膏中低聚三糖的分离纯化方法
：本专利技术属于中药领域，具体涉及一种复方丹参浸膏中低聚三糖的分离纯化方法。
技术介绍
：复方丹参滴丸是由丹参、三七和冰片制成的滴丸剂，在临床上广泛用于冠心病、心绞痛的预防、治疗、急救，现已成为国内心血管市场上的主导品牌之一。复方丹参浸膏为复方丹参滴丸的制剂中间体，是由丹参和三七药材，经水提、醇沉、浓缩后得到的浸膏（复方丹参浸膏的制备方法属于现有技术）。复方丹参滴丸上市十余年中逐步建立了完善的工艺质量控制体系，目前正在以药品的形式进行FDA申报研究。但是相对于西药，复方丹参浸膏目前的已知组分仍然较低，提升产品工艺质量控制水平，需要针对其中更多的中药化学成分进行深入研究，从而更加准确地把握产品质量，降低用药风险，同时为国际注册提供支持。糖类在中草药中分布十分广泛，也是中药材及中药产品中的主要组成成分，所占含量比例很高。测定结果表明，复方丹参浸膏中的糖类成分含量达到约50%，因此糖类成分的研究对于复方丹参浸膏的全面质量控制有着重要意义。从复方丹参浸膏中分离出了多种糖类成分，获得这些成分可以用于分析复方丹参滴丸中不同糖类成分的比例关系，了解它们的作用，同时可以用于控制产品的质量。本专利技术在于提供一种从复方丹参浸膏中分离低聚三糖成分的方法，该方法快速，准确，操作简单，分离效果好，得到的产品纯度高，收率高，可用于糖类成分的定性和定量检测。
技术实现思路
：本专利技术经过长期反复的摸索，最终得到一种复方丹参浸膏中低聚三糖的分离纯化方法，并对该低聚三糖进行了结构确认，确认该化合物为α-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-呋喃果糖-(1→1)-α-D-吡喃半乳糖。该分离纯化方法包括如下步骤：（1）复方丹参浸膏总糖提取物的制备；（2）复方丹参浸膏总糖提取物过聚丙烯酰胺凝胶层析柱；（3）低聚三糖成分的收集。其中步骤（1）所述复方丹参浸膏总糖提取物的制备方法为：复方丹参浸膏加水超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱，流速为0.5-1.0mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液，蒸干，得复方丹参浸膏总糖提取物。其中所述固相萃取柱采用CleanertPS-SPE萃取柱，使用前经过处理，处理方法为：将固相萃取柱用甲醇冲洗，之后再用水冲洗。其中所述复方丹参浸膏为丹参和三七药材经水提、醇沉、浓缩后得到的浸膏，其制备方法具体为：分别取41.06份丹参、8.03份三七药材，粉碎，放入提取罐中，加入上述生药5倍量的碱水(pH=7.0)，提取2小时，过滤，收集初滤液，药渣加入4倍量水，煎煮1小时，滤过，与第一次提取的滤液混合，减压浓缩，直至溶液体积(L)与生药质量(Kg)的比为0.9-1.1，加入95%的乙醇直至含醇量至69-71%，静置12小时，滤过，滤液浓缩回收乙醇成浸膏，相对密度为1.32-1.40。该方法属于现有技术。其中步骤（2）所述过聚丙烯酰胺凝胶层析柱是将得到的复方丹参浸膏总糖提取物用超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱的柱温为35-45℃，用超纯水进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集相当于0.65-0.75柱体积时的流份。其中，聚丙烯酰胺凝胶层析柱为现有技术，可以用以下方法得到：称取一定量的聚丙烯酰胺凝胶，倒入超纯水中，在室温下润涨12小时以上，真空脱气，装柱到需要的高度（100~120cm），再用2~3倍床体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱。优选的，步骤（2）中层析柱的柱温为40℃。步骤（2）中所述上样量为0.075-0.125g复方丹参浸膏总糖提取物/100克聚丙烯酰胺凝胶。步骤（2）中所述层析柱的洗脱流速为0.0184-0.0367柱体积/小时。其中步骤（3）所述的低聚三糖成分的收集方法为：用HPLC方法对洗脱液进行检测，收集保留时间为27.5±0.2min的洗脱液，蒸干，得到洗脱物低聚三糖。所述HPLC对洗脱液进行检测的方法为：采用HPLC-ELSD法，HPLC采用PrevailTMCarbohydrateES色谱柱，色谱条件为以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱设置为：流速0.8mL/min，柱温30℃；采用ELSD检测器，检测器参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Nebheater为60%。本专利技术的洗脱物低聚三糖的结构确认方法为高分辨质谱、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMQC、H-HCOSY、HSQC、H-Htcosy、HMBC核磁扫描。ESI-MS（m/z）：高分辨质谱测得本品的[M+Na]+峰的质量数为527.1583，与C18H32O16理论计算值527.1583的相对误差为-0.16ppm，表明由高分辨质谱给出的最为匹配的分子式C18H32O16，故该待测化合物的化学式C18H32O16。1H-NMR(D2O，500MHz)：δ5.19为葡萄糖上的端基氢信号，双峰，耦合常数为3.7，说明该糖为α构型，是1位氢（1H，d，J-3.7，1-H）；δ4.64为半乳糖上的端基氢的信号，双峰，说明该糖为α构型，是1位氢（1H，d，J-3.7，1-H）。13C-NMR(D2O，125MHz)：δ104.04为呋喃果糖2位的碳信号（1C，2-C），δ99.06为吡喃半乳糖1位的碳信号（1C，1-C），δ91.63为吡喃葡萄糖1位为的碳信号（1C，1-C）。DEPT：通过DEPT确定呋喃果糖2位的碳为季碳。HSQC：δ91.63与δ5.19有相关，δ104.04（1C，2-C）为呋喃果糖2位的碳信号与δ3.47和δ2.72为呋喃果糖1位的氢信号（2H，d，J1a,1b=11.5，1a-H，1b-H）有相关；HMBC：δ66.68为呋喃果糖1位的碳信号（1C，1-C）与δ5.19为吡喃葡萄糖1位的氢信号（1H，d，J-3.7，1-H）；δ99.06为吡喃半乳糖1位的碳信号（1C，1-C）与δ3.47和δ3.72为呋喃果糖2位的氢信号（2H，d，J1a,1b=11.5，1a-H，1b-H）有远程相关。说明该糖的连接位点与连接顺序为α-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-呋喃果糖-(1→1)-α-D-吡喃半乳糖。1H-NMR（D2O，500MHz）与13C-NMR（D2O，125MHz）的谱图数据及类别归属在表1中给出。表11H-NMR与13C-NMR数据汇总表1中汇总的图谱数据经查阅，与文献报道α-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-呋喃果糖-(1→1)-α-D-吡喃半乳糖一致。因此确定该化合物为α-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-呋喃果糖-(1→1)-α-D-吡喃半乳糖。该低聚三糖的结构见图2。图谱见图3~10。附图说明：图1复方丹参浸膏总糖提取物ELSD-HPLC色谱图图2本专利技术分离纯化出的低聚三糖的结构图3本专利技术低聚三糖的1H-NMR图谱图4本专利技术低聚三糖的13C-NMR图谱图5本专利技术低聚三糖的ESI-MS图谱图6本专利技术低聚三糖的DEPT图谱图7本专利技术低聚三糖的H-Hcosy图谱图8本专利技术低聚三糖的H-Htocsy图谱图9本专利技术低聚三糖的HSQC图谱图10本专利技术低聚三糖的HMBC图谱具体实施方式：下面通过具体的实施例进一步说明本专利技术，下述实施例是用于说明本专利技术而不是对本专利技术的限制，根据本专利技术的实质对本专利技术进行的简单改进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复方丹参浸膏中低聚三糖的分离纯化方法，包括如下步骤：（1）复方丹参浸膏总糖提取物的制备；（2）复方丹参浸膏总糖提取物过聚丙烯酰胺凝胶层析柱；（3）低聚三糖成分的收集。

【技术特征摘要】
1.一种复方丹参浸膏中低聚三糖的分离纯化方法，包括如下步骤：(1)复方丹参浸膏总糖提取物的制备；(2)复方丹参浸膏总糖提取物过聚丙烯酰胺凝胶层析柱；(3)低聚三糖成分的收集；其中，所述低聚三糖为α-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-呋喃果糖-(1→1)-α-D-吡喃半乳糖。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(1)所述复方丹参浸膏总糖提取物的制备方法为：复方丹参浸膏加水超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱，流速为0.5-1.0mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液，蒸干，得复方丹参浸膏总糖提取物。3.如权利要求2所述的方法，其中所述固相萃取柱采用CleanertPS-SPE萃取柱，使用前经过处理，处理方法为：将固相萃取柱用甲醇冲洗，之后再用水冲洗。4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(2)所述过聚丙烯酰胺凝胶层析柱是将得到的复方丹参浸膏总糖提取物用超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱的柱温为35-45℃，用超纯水进行洗脱，收集相当于0.65-0.75柱体积时的流份。5.如权利要求4所述的方法，其中，聚丙烯酰胺凝胶层析柱用...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐波，牛涛，陈红，刘岩，
申请(专利权)人：天津天士力现代中药资源有限公司，
类型：发明
国别省市：