用于分泌性蛋白表达的融合蛋白制造技术

本发明专利技术提供了一种适合于多于一种感兴趣多肽（POI）的分泌的融合蛋白，其包括信号肽、POI、包含来自自转运蛋白的β茎部结构域的载客结构域、以及来自自转运蛋白的易位蛋白结构域，其中该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的并且该（这些）POI与该β茎部结构域融合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于分泌性蛋白表达的融合蛋白
本专利技术总体上涉及一种新的融合蛋白和一种用于分泌性蛋白表达的方法。
技术介绍
分泌性蛋白表达是宿主细胞中蛋白质的表达，其中该蛋白质输出至细胞膜并且以可溶性方式释放至培养基中或保持与细胞膜连接。分泌性蛋白表达由处在蛋白质N端的信号肽介导，该信号肽指导多肽到达细胞膜。通常，在原核宿主如大肠杆菌中产生的重组蛋白以胞内方式产生。当蛋白质以这种方式回收时，不得不裂解细胞，这导致重组蛋白被细胞内容物污染。随后不得不从全细胞提取物中以多步骤纯化流程回收蛋白质，这费时并且导致低劣产率。将重组蛋白分泌至培养基中是一项更好的策略，因为从用过的培养基中纯化蛋白质较容易并且与连续培养更相容。然而，现有系统不具有高效的产率。其中蛋白质保持与细胞表面连接的分泌性蛋白表达具有其他用途。这种类型的蛋白质表达的用途的实例包括活疫苗开发、表位定位、生物吸附剂和生物传感器开发和为发现药物而高通量筛选蛋白质和肽文库。在表面展示和分泌中，重组蛋白面临跨过复杂大肠杆菌细胞包膜易位的挑战，该细胞包膜由两个脂质膜(内膜和外膜)组成，在其间存在凝胶样区室(周质)。已经显示这种易位是十分困难的并且先前使用的方法具有低效力。自转运蛋白是巨大的蛋白质，它们由革兰氏阴性细菌如(大肠杆菌)分泌。自转运蛋白系统在以下意义上是简单的：认为自转运蛋白，如其名称暗示，在蛋白质自身内部携带用于跨周质和外膜易位的全部信息。然而，借以自转运蛋白分泌的机制仍是不完全理解的。自转运蛋白合成为巨大的前体蛋白，该前体蛋白含有3个主要结构域：(i)将蛋白质靶向Sec易位子并启动跨内膜转移的N端信号肽，(ii)包含待分泌的“载货”蛋白的载客结构域和(iii)包含β桶结构的C端成孔结构域(易位蛋白结构域)，其中该β桶结构整合至外膜中并且在载客结构域跨越外膜易位至胞外空间中发挥关键但不清楚的作用。在易位后，载客结构域从易位蛋白结构域中被切下并释放至胞外环境中。在一些情况下，载客结构域保持与细胞表面非共价地连接。可以通过(外部)蛋白酶对位于易位蛋白结构域和载客结构域之间的蛋白酶基序发挥作用来实现切割。可替代地，切割通过易位蛋白结构域和载客结构域之间特定位点处的分子内自催化事件发生。自转运蛋白的载客结构域包含β茎部结构和侧面结构域。β茎部是由延长的β螺旋形成的伸长结构。载客结构域的C端包含已经参与载客结构域折叠和跨外膜易位的自伴侣结构域。Hbp是属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)丝氨酸蛋白酶自转运蛋白(SPATE)亚家族的自转运蛋白。Hbp的载客结构域的晶体结构最近已经测定(Otto等人，2005,J.BiolChem(《生物化学杂志》)280(17)：17339-45)，并且如图11A显示。该结构展示这种多肽形成长的右手β-螺旋结构(“β茎部”)。Hbp的载客结构域包含两个较大的侧面结构域：结构域d1和结构域d2，其中d1包含该蛋白质的丝氨酸蛋白酶活并且d2具有未知的功能。还存在3个较小的侧面结构域：结构域3(d3)、结构域4(d4)和结构域5(d5)。还已经显示了其他自转运蛋白如百日咳杆菌粘着素(Emsley等人，1996Nature(《自然》)381：90-92)和IgA蛋白酶(Johnson等人，2009JMolBiol(《分子生物学杂志》)389(3)：559-74)的相似β茎部结构域。先前已经尝试使用自转运蛋白用于大肠杆菌中的分泌性蛋白表达，大多使用经工程化用于表面展示目的的奈瑟氏菌IgA蛋白酶(Pyo等人，2009Vaccine(《疫苗》)272030-2036)和内源性大肠杆菌自转运蛋白AIDA-I(VanGerven等人，2009Microbiology(《微生物学》)155:468-476)的变体。使用IgA蛋白酶和AIDA-I用于分泌重组蛋白的尝试使用了导致分泌和表面暴露的蛋白质的低劣产率的构建体(Pyo等人，2009Vaccine(《疫苗》)272030-2036；VanGerven等人，2009Microbiology(《微生物学》)155:468-476)。在大多数的这类研究中，完整或几乎完整的内源性载客结构域由重组蛋白替换。迄今，自转运蛋白已经主要用作展示平台，而非用于可溶性形式的异源蛋白质的分泌，其中该蛋白质被分泌至培养基中。IgA蛋白酶需要附属蛋白酶用于加工，而AIDA-I在切割后保持与外膜非共价地连接。因此，这些自转运蛋白可能仅用于表位和蛋白质的表面呈递。先前已经显示了与Hbp载客结构域融合的钙调蛋白的高效展示和分泌(Jong等人，2007MolecularMicrobiology(《分子微生物学》)63:1524-1536)。为了最小化对载客结构域的天然β-茎部的扰动，钙调蛋白替换Hbp载客结构域的结构域2。对于某些应用，从细胞表面分泌或展示多于一种感兴趣蛋白(POI)的可能性是十分有用的。这类应用包括疫苗，例如其中两个或更多个表位展示在相同的细胞表面上；酶展示，其中多于一个酶展示在细胞表面上来以一系列步骤实施众多催化反应；肽文库暴露和抑制剂筛选。对于多价疫苗，特别有用的是具有一种系统，其中一个宿主细胞群体可以表达并展示或分泌多种抗原，而非具有细胞群体的混合物，每个群体仅展示或分泌这些抗原之一。仅具有展示或分泌多种抗原的一个细胞群体具有更易生产和更好控制疫苗含量的优点。总之，需要改进的分泌表达系统，这些系统用于展示异源蛋白质以及将异源蛋白质以可溶性形式分泌至培养基中。也需要的一种系统和一种方法，其能够在宿主细胞的细胞表面上使多于一个感兴趣蛋白进行分泌性蛋白表达或分泌多于一种蛋白质至培养基中。专利技术目的本专利技术的一个目的是提供感兴趣多肽(POI)从宿主细胞中的高效分泌。本专利技术的第二目的是提供POI在宿主细胞表面上的高效展示。本专利技术的第三目的是提供POI向其中培养宿主细胞的培养基中的高效可溶性分泌。本专利技术的又一个目的是提供用于多于一种POI的高效分泌(即展示或可溶性分泌)的支架。专利技术简述在本专利技术的第一方面，提供了能够表达多于一种(如至少两种)POI(感兴趣蛋白)的宿主细胞。这些POI包含于一种融合蛋白中，该融合蛋白还包含载客结构域(其包含来自自转运蛋白的β茎部结构域)、来自自转运蛋白的易位蛋白结构域和能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌内膜的信号肽。该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的并且这些POI与该载客结构域融合。与其他系统相比，用于分泌性蛋白表达的这种宿主细胞具有几个优点，包括但不限于更高效地分泌多于一种POI。另外，当目标是展示POI时，随着POI将进一步离开细胞表面并且更稳定，β茎部结构域将能够实现更高效的展示。在本专利技术的宿主细胞的一个实施例中，自转运蛋白的天然形式的载客结构域包含从β茎部结构域突出的至少一个侧面结构域。POI随后可以插入、替代或部分替代这种侧面结构域。在另一个实施例中，自转运蛋白的天然形式的载客结构域包含至少两个侧面结构域。每种POI随后可以插入、替代或部分替代独立的这种侧面结构域，或POI可以插入、替代或部分替代相同的侧面结构域。POI也可以与来自自转运蛋白的独立的载客结构域、易位蛋白结构域和信号肽融合。在本专利技术的第二方面，提供一种融合蛋白，该融合蛋白包含多于一种(如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.28 SE 1051000-61.一种能够表达多于一种感兴趣多肽POI的宿主细胞，该宿主细胞是革兰氏阴性细菌且包含融合蛋白或编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含所述POI以及i.一种包含来自属于pfam自转运蛋白家族PF03797的自转运蛋白的β茎部结构域的载客结构域，其中该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的，所述β茎部形成序列是基本上完整的是指与破坏或完全除去β茎部时相比，蛋白质的分泌功能的效率维持在最佳水平并且也指在分泌后，载客结构域的稳定性得到维持；ii.一种来自属于pfam自转运蛋白家族PF03797的自转运蛋白的易位蛋白结构域；和iii.一种能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌内膜的信号肽；其中处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域包含至少两个侧面结构域，并且其中至少两种POI插入、替代或部分替代不同的侧面结构域。2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中在表达时，该融合蛋白在该细胞表面展示。3.根据权利要求1-2中任一项所述的宿主细胞，其中在表达时，该融合蛋白从该细胞表面分泌并且释放。4.根据权利要求1-2中任一项所述的宿主细胞，其中i)中的载客结构域和ii)中的易位蛋白结构域源自一种肠杆菌科的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白SPATE。5.根据权利要求所述4的宿主细胞，其中该SPATE蛋白是来自大肠杆菌的血红蛋白结合蛋白酶Hbp、胞外丝氨酸蛋白酶EspC或温度敏感性血凝素Tsh。6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其中该SPATE蛋白由序列为SEQIDNO1或SEQIDNO2的多肽组成。7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其中SEQIDNO1或SEQIDNO2的氨基酸53-308、533-608、657-697、735-766和898-922对应于多个侧面结构域，并且其中这些POI插入、替代或部分替代至少两个这类侧面结构域。8.一种融合蛋白，其包含i.多于一种感兴趣多肽POI；ii.一种包含来自属于pfam自转运蛋白家族PF03797的自转运蛋白的β茎部结构域的载客结构域，其中该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的，所述β茎部形成序列是基本上完整的是指与破坏或完全除去β茎部时相比，蛋白质的分泌功能的效率维持在最佳水平并且也指在分泌后，载客结构域的稳定性得到维持；iii.一种来自属于pfam自转运蛋白家族PF03797的自转运蛋白的易位蛋白结构域；和iv.可任选地，一种将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌内膜的信号肽，其中处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域包含至少两个侧面结构域，并且其中至少两种POI替代或部分替代独立的侧面结构域。9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中i)中的载客结构域和ii)中的易位蛋白结构域源自一种肠杆菌科的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白SPATE。10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中该SPATE蛋白是来自大肠杆菌的血红蛋白结合蛋白酶Hbp、胞外丝氨酸蛋白酶EspC或温度敏感性血凝素Tsh。11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中该SPATE蛋白由序列为SEQIDNO1或SEQIDNO2的多肽组成。12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中SEQIDNO1或SEQIDNO2的氨基酸53-308、533-608、657-697、735-766和898-922对应于多个侧面结构域，并且其中这些POI插入、替代或部分替代至少两个这类侧面结构域。13.一种经安排用于表达融合蛋白的核酸，所述核酸在框内包含：i.编码所述融合蛋白的信号肽的序列，该信号肽能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌的内膜；ii.编码所述融合蛋白的载客结构域的序列，该载客结构域包含来自属于pfam自转运蛋白家族PF03797的自转运蛋白的β茎部结构域；以及iii.编码所述融合蛋白的易位蛋白结构域的序列，该易位蛋白结构域源自属于pfam自转运蛋白家族PF03797的自转运蛋白，其中该编码处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域的序列包含至少两段序列，这些序列编码从该β茎部结构域突出的侧面结构域，并且其中该编码载客结构域的序列包含允许框内地克隆至少两个编码感兴趣多肽POI的DNA序列的至少两段克隆位点序列，所述至少两段克隆位点序列插入、替代或部分地替代所述编码侧面结构域的序列段的独立段，并且所述克隆位点序列段如此安排，从而该载客结构域的所编码的β茎部形成蛋白序列是基本上完整的，所述β茎部形成序列是基本上完整的是指与破坏或完全除去β茎部时相比，蛋白质的分泌功能的效率维持在最佳水平并且也指在分泌后，载客结构域的稳定性得到维持。14.一种经安排用于表达融合蛋白的核酸，所述核酸在框内包含：i.编码所述融合蛋白的信号肽的序列，该信号肽能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌的内膜；ii.编码所述融合蛋白的载客结构域的序列，该载客结构域包含来自属于pfam自转运蛋白家族PF03797的自转运蛋白的β茎部结构域；iii.编码所述融合蛋白的易位蛋白结构域的序列，该易位蛋白结构域源自属于pfam自转运蛋白家族PF03797的自转运蛋白；和iv.编码所述融合蛋白的多于一种感兴趣多肽POI的序列，其中这些编码POI的序列与该编码载客结构域的序列融合并且如此安排，从而该载客结构域的所编码的β茎部形成蛋白序列是基本上完整的，所述β茎部形成序列是基本上完整的是指与破坏或完全除去β茎部时相比，蛋白质的分泌功能的效率维持在最佳水平并且也指在分泌后，载客结构域的稳定性得到维持，并且其中该编码处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域的序列包含至少两段序列，这些...

【专利技术属性】
技术研发人员：约恩·路易林克，沃特·S·P·钟，
申请(专利权)人：阿贝拉生物科学公司，
类型：
国别省市：