一种谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法技术

本发明专利技术公开了一种高新生物技术，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法，pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上。尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高新生物技术，尤其涉及。
技术介绍
在细菌和植物中，由公共途径莽草酸途径以及三个专一性途径分别合成色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸三种芳香族氨基酸，公共途径第一步反应，被认为是芳香族氨基酸合成的限速步骤，由DAHP合成酶催化。目前，对谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)DAHPSCgTyr的立体结构还未见报道，但大肠杆菌Escherichia col1、海栖热袍菌Thermotoga maritima、啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae的(β /a )8立体桶状结构均以报道，这些来源不同的DAHPS高度同源，功能相同，只是受不同底物的反馈抑制，但底物抑制的结合位点基本相同，表明它们可能是由同一个桶状结构的祖先进化而来，或者是由不定的结构收敛进化到同一种稳定的三维结构的结果，或者是二者兼有的结果。1991年的大肠杆菌中进化高度保守的苯丙氨酸反馈抑制的DAHPS的(DAHPSEcPhe)金属离子结合位点Cys61、Glu302、Asp326、Lys97中的Cys61进行突变研究，结果该氨基酸的突变导致酶活性丧失，推测谷氨酸棒杆菌酪氨酸反馈抑制的DAH本文档来自技高网...

【技术保护点】
谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法，其特征在于：所述方法所使用的材料为菌株大肠杆菌BL21及pET?28a(+)原核表达载体，由以下步骤实现：1)、DAHP合成酶基因及突变基因的原核表达载体构建；2)、目的基因与表达载体pET?28a(+)的酶切，限制性内切酶Nde?I和Xho?I双酶切重组质粒pMD18T?simple?Aro?I和pMD18T?simple?Aro?I*，回收目的基因片段，分别按照下表中体系进行加样，对目的基因和pET?28a(+)载体于37℃恒温4h进行双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳结果，回收目的基因和载体的目的片段；3)、回收片段的连接，将回收...

【技术特征摘要】
1.谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法，其特征在于:所述方法所使用的材料为菌株大肠杆菌BL21及pET-28a(+)原核表达载体，由以下步骤实现: 1)、DAHP合成酶基因及突变基因的原核表达载体构建； 2)、目的基因与表达载体pET-28a(+)的酶切，限制性内切酶NdeI和X...

【专利技术属性】
技术研发人员：佟毅，刘俊梅，王宏龄，胡耀辉，李琢伟，王丹，王玉华，朴春红，代伟长，于寒松，
申请(专利权)人：吉林中粮生化科技有限公司，
类型：发明
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