用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用。该重组DNA包含解除了L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶反馈抑制的编码天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶的DNA序列、编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的DNA序列、编码二氨基庚二酸脱氢酶的DNA序列以及编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的DNA序列。该菌株包含导入上述重组DNA而转化过的大肠杆菌。本发明专利技术采用表达L-赖氨酸产生菌L-赖氨酸生物合成基因，能大大提高L-赖氨酸的产量；且根据控制发酵过程中的葡萄糖和硫酸铵浓度使L-赖氨酸的产量和糖酸转化率可得到进一步提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及L-赖氨酸的生产方法，特别涉及一种用于发酵生产L-赖氨酸的DNA、菌株及方法，属于微生物工程

技术介绍
发酵法生产L-赖氨酸，大多采用从自然环境分离的微生物菌株并由此微生物菌株得到的人工突变株。已知的高产人工突变株大多为S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、磺胺胍(SG)、赖氨酸乙酯盐酸盐(Lys-OEt)等抗性，且多为高丝氨酸缺陷型或苏氨酸缺陷型和蛋氨酸缺陷型，并且属于埃希氏属、棒杆菌属，短杆菌属。就埃希氏属来说，根据专利公开号CN 1423691A披露了通过增强来源于大肠杆菌脱敏的天冬氨酸激酶II1、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和天冬氨酸- β -半醛脱氢酶来增加L-赖氨酸的产量。就棒杆菌和短杆菌属来说，根据专利公开号CN 100451104C中的报道，通过增强丙酮酸羧化酶、二氢吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸激酶、L-赖氨酸输送蛋白和二氢吡啶二羧酸还原酶来增加L-赖氨酸的产量。在大肠杆菌中，L-赖氨酸合成以草酰乙酸为前体，通过过量表达来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，将磷酸烯醇式丙酮酸直接羧化为草酰乙酸，增加了 L-赖氨酸合成的前体；通过过量表达来源于大肠杆菌的脱敏的天冬氨酸激酶III和天冬氨酸-β -半醛脱氢酶来增加天冬氨酸代谢途径的代谢通量；通过过量表达来源于大肠杆菌的脱敏的二氢吡啶二羧酸合酶和来源于棒杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶来增加L-赖氨酸合成的代谢流量。但是，上述用于增强表达大肠杆菌中L-赖氨酸合成途径关键酶的质粒都需要在表达的基因前面加入启动子，例如专利CN 1423691Α所述的pCABDEl过量表达了 lysC、dapA、dapB、ddh、dapE这5个基因，其中dapA受Ptet启动子的控制，lysC、dapB、ddh和dapE分别受4个Plac启动子的控制。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是克隆L-赖氨酸产生菌L-赖氨酸生物合成途径关键酶的基因，并解析其序列。本专利技术的另一目的是获得对L-赖氨酸脱敏的天冬氨酸激酶III和二氨基庚二酸合酶。本专利技术的又一目的是表达L-赖氨酸生物合成途径的酶的基因，提高L-赖氨酸的产量。此外， 本专利技术的目的还包括提供一种大肠杆菌菌株，其中如下L-赖氨酸生物合成途径的酶的活性得到增强:①IysC基因编码的天冬氨酸激酶III ；②dapA基因编码的二氨基庚二酸合酶；③PPC基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；④asd基因编码的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶；⑤ddh基因编码的二氨基庚二酸脱氢酶。本专利技术的目的还包括提供一种发酵L-赖氨酸的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用了如下技术方案:一种用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA，包括解除了 L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶反馈抑制的编码天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶的DNA序列、编码天冬氨酸-β -半醛脱氢酶的DNA序列、编码二氨基庚二酸脱氢酶的DNA序列以及编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的DNA序列。具体而言，所述解除了 L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III的反馈抑制的天冬氨酸激酶III从N端开始计算，该天冬氨酸激酶111催化亚基的第318位氨基酸由蛋氨酸变为异亮氨酸；第323位氨基酸由甘氨酸变为天冬氨酸，其序列见SEQ ID NO: 14，且该二氢吡啶二羧酸合酶调节亚基的第118位氨基酸由组氨酸变为酪氨酸，其序列见SEQ ID NO:15。所述天冬氨酸-β -半醛脱氢酶是来源于大肠杆菌的编码天冬氨酸-β -半醛脱氢酶，其包含与SEQ ID NO: 16实质相同的氨基酸序列。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，其包含与SEQ ID NO: 18实质相同的氨基酸序列。所述二氨基庚二酸脱氢酶是来源于棒状杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶，其包含与SEQ ID NO: 17实质相同的氨基酸序列。包含如上所述重组DNA的表达质粒pWG-aACPD。一种大肠杆菌，包含如上所述的重组DNA。一种大肠杆菌，是导入如上所述的重组DNA或表达质粒pWG-aACPD而转化过的。如上所述大肠杆菌在发酵生产L-赖氨酸工艺中的应用。一种生产L-赖氨酸的方法，包括:在发酵培养基中对如上所述的大肠杆菌进行培养以生产L-赖氨酸。作为特别优选的实施方案，所述培养温度在37°C，培养时间在48h左右。根据本专利技术，在大肠杆菌中表达L-赖氨酸产生菌种的L-赖氨酸合成基因，根据L-赖氨酸生物合成酶的最适温度，采用高温短时发酵，菌株的代谢强度得到提高，L-赖氨酸生物合成酶的活性提高，L-赖氨酸的产量和糖酸转化率提高。本专利技术可被运用于采用棒状杆菌的L-赖氨酸的生产。为达成上述目标，本案专利技术人进行了长期研究和大量实践，并发现与现有技术相t匕，本专利技术采用表达L-赖氨酸产生菌L-赖氨酸生物合成基因，能大大提高L-赖氨酸的产量；且根据L-赖氨酸生物合成酶的最适温度，构建发酵模型，尤其是高温短时发酵模型，菌株的代谢强度得到提高， L-赖氨酸生物合成酶的活性提高，L-赖氨酸的产量和糖酸转化率可得到进一步提闻。附图说明图1是由葡萄糖生物合成L-赖氨酸路线图及其关键酶基因；图2是表达质粒pWG-aACPD的构建图谱；图3是大肠杆菌JNU-11/pWG-aACPD发酵生产L-赖氨酸的进程曲线图。具体实施方式作为本专利技术的一种典型应用方式，本专利技术的技术方案可以包括:1、用于提供L-赖氨酸生物合成基因的L-赖氨酸产生菌株的筛选“L-赖氨酸产生菌株”是指在培养基中培养该菌株时，有在培养基中积累L-赖氨酸的能力。L-赖氨酸产生菌株大多为从自然环境分离的微生物菌株并由此微生物菌株得到的人工突变株。如营养缺陷型突变株、结构类似物抗性株或者代谢调节突变株等，且营养缺陷型突变、结构类似物抗性或者代谢调节突变等特性可以单独赋予或者两项或多项联合赋予。已知的高产人工突变株大多为S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、磺胺胍(SG)、赖氨酸乙酯盐酸盐(Lys-OEt)等抗性，且多为高丝氨酸缺陷型或苏氨酸缺陷型和蛋氨酸缺陷型。L-赖氨酸产菌大致有:大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium fIavum)和乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)等诱变选育而来。2、L-赖氨酸产生菌L-赖氨酸生物合成途径关键酶基因的解析和制备L-赖氨酸生物合成途径关键酶来源于上述产L-赖氨酸大肠杆菌，具有营养缺陷型突变、结构类似物抗性和代谢调节突变的特性。(I)用于本专利技术方法中编码天冬氨酸激酶III的基因IysCf:用于本专利技术方法中的编码突变体天冬氨酸激酶III具有突变，解除了 L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III的反馈抑制:从N端开始计算，该天冬氨酸激酶III催化亚基的第318位氨基酸由蛋氨酸变为异亮氨酸；第323位氨基酸由甘氨酸变为天冬氨酸。(2)用于本专利技术方法中编码突变体二氢吡啶二羧酸合酶的基因dapA*:用于本专利技术方法中的编码突变体二氢吡啶二羧酸合酶具有突变，解除了 L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III的反馈抑制:从N端开始计算，二本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于发酵生产L?赖氨酸的重组DNA，其特征在于：包括解除了L?赖氨酸对天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶反馈抑制的编码天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶的DNA序列、编码天冬氨酸?β?半醛脱氢酶的DNA序列、编码二氨基庚二酸脱氢酶的DNA序列以及编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的DNA序列。

【技术特征摘要】
1.用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA，其特征在于:包括解除了L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶反馈抑制的编码天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶的DNA序列、编码天冬氨酸- β -半醛脱氢酶的DNA序列、编码二氨基庚二酸脱氢酶的DNA序列以及编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的DNA序列。2.如权利要求1所述的用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA，其特征在于，所述解除了L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III的反馈抑制的天冬氨酸激酶III，从N端开始计算，该天冬氨酸激酶III催化亚基的第318位氨基酸由蛋氨酸变为异亮氨酸，第323位氨基酸由甘氨酸变为天冬氨酸；并且该二氢吡啶二羧酸合酶调节亚基的第118位氨基酸由组氨酸变为酪氨酸。3.如权利要求1所述的用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA，其特征在于，所述天冬氨酸-β -半醛脱氢酶来源于大肠杆菌的编码天冬氨酸-β -半醛脱氢酶。4.如权利要求1所述的用于发酵生产...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟国，宋灿辉，钱和，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：