大肠杆菌O157:H7核酸适体及其应用方法技术

本发明专利技术涉及大肠杆菌O157:H7核酸适体及其应用方法。本发明专利技术提供了一种大肠杆菌O157:H7核酸适体，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。本发明专利技术所述的大肠杆菌O157:H7核酸适体具有特异性好、亲和力高、稳定性好、开发周期短、生产成本低、使用方便等优点。本发明专利技术提供了一种大肠杆菌O157:H7检测试剂，含有本发明专利技术所述的核酸适体。本发明专利技术提供了一种用于大肠杆菌O157:H7的分离富集方法。本发明专利技术所述的检测试剂和分离富集方法，可以快速、有效、方便地分离出大肠杆菌O157:H7。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种核酸适体，特别涉及大肠杆菌0157:H7核酸适体及其应用方法。
技术介绍
据世界卫生组织最新报道，全球每年发生腹泻的病历数高达15亿，由此造成了百万儿童死亡，其中70%的病例归咎于各种污染食品的微生物。大肠杆菌是最常见的食源性病原微生物，而其中的0157:H7型是一种强致病性的病原菌，该种病原菌常见于牛等温血动物的肠内，可通过水和未加工熟的食物感染人。该型的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，引起患者出现严重的水泻、带血腹泻、发烧、腹绞痛及呕吐，情况严重时，更可能并发急性肾病甚至败血症。5岁以下的儿童出现该等并发症的风险较高。目前该类病原菌的检测方法主要有分离培养法、酶联免疫法和核酸检测法。以上方法要么检测周期久，要么操作复杂、检测成本高、检阳性假阴性率高，以上方法都面临一个病原菌快速分离富集的问题，现阶段多采用过滤或梯度离心法，操作复杂效果差，严重制约了检测产品的普及。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种大肠杆菌0157:H7核酸适体。本专利技术所述的大肠杆菌0157:H7核酸适体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。SEQ ID NO:1:TTTACTATCCCCCCATATTTCCAAATTCCCGCCCTTTGGAAATATGAAAATAG。本专利技术的核酶适体既包括原始的核苷酸序列，也包括对该原始核苷酸进行修饰/改性得到的序列，修饰/改性的方法包括但不限于对核苷酸本身的化学修饰，化学修饰包括但不限于氨基、巯基、羧基或同位素等修饰；或在核苷酸序列的末端偶联生物素、连接核苷酸序列、酶、发光基团等。该核酸序列是通过SELEX技术(指数富集的配基系统进化技术)筛选特异高效结合大肠杆菌0157:H7的核酸序列而得到的，该序列可用于样本中大肠杆菌0157:H7的富集及检测。本专利技术的第二个目的是提供一种大肠杆菌0157:H7检测试剂。本专利技术所述的大肠杆菌0157:H7检测试剂，含有本专利技术所述的序列为SEQ ID NO:I的核酸适体。本专利技术的第二个目的是提供一种用于大肠杆菌0157:H7的分离富集方法。本专利技术所述的用于大肠杆菌0157:H7的分离富集方法，是采用本专利技术所述的核酸适体用于大肠杆菌0157:H7的分离富集方法，包括以下步骤:(I)将本专利技术所述的核酸适体的5’端偶联在可分离载体上，得到分离富集载体；(2)将样本与分离富集载体充分混合，富集得到大肠杆菌0157:H7和复合载体与所述的核酸适体的复合体；(3)将复合载体上的大肠杆菌洗脱，得到从所述样品中分离的大肠杆菌0157:H7。根据本专利技术所述的分离富集方法的进一步特征，所述的如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列是通过连接序列偶联在可分离载体上。根据本专利技术所述的分离富集方法的进一步特征，所述步骤(I)中，所述的可分离载体为磁珠，将氨基化修饰的核酸适体与羧基磁珠在EDC催化下进行偶联。根据本专利技术所述的分离富集方法的进一步特征，所述步骤(I)中，所述的可分离载体为微球，将氨基化修饰的核酸适体与羧基微球在EDC催化下进行偶联。。根据本专利技术所述的分离富集方法的进一步特征，连接序列为3 12个核苷酸序列。此核苷酸序列为不影响核酸适体二级结构的随意序列。该连接序列可避免核酸适体直接偶联在载体上而导致核酶序列与目标序列因为存在空间位阻而不能很好的结合。优选地，可以在核酶适体的5’端连接若干个核苷酸作为连接序列。本专利技术所述的大肠杆菌0157:H7核酸适体，特异性好，亲和力高，稳定性好、生产成本低、使用方便。该适体对样本中的大肠杆菌0157:H7回收效率达到98%，与其它非特异结合的菌体交叉小于2% ;使用成本不到抗体的百分之一，且可反复变性复性稳定性好。利用本专利技术所述的检测试剂，可以快速、有效、方便地检测出大肠杆菌0157:H7。因此，本专利技术也提供一种可以快速、有效、方便地分离出大肠杆菌0157:H7的分离富集方法。附图说明图1是大肠杆菌0157: H7核酸适体偶联磁珠及对靶标菌体富集的一个实施例的示意图。具体实施例方式下面结合实施例和附图进一步说明本专利技术。如图1所示，氨基化修饰的核酸适体与羧基磁珠在EDC催化下偶联，产物经过清洗后与含有大肠杆菌0157:H7的样本混合，结合后再经PBS两次清洗，磁性富集得到大肠杆菌0157: H7和磁珠核酸适体的复合体，样本中的大肠杆菌0157: H7的得到富集。实施例1:大肠杆菌0157:H7的分离富集。合成大肠杆菌0157:H7核酸适体，其核苷酸序列如下所示:5’ -TTTACTATCCCCCCATATTTCCAAATTCCCGCCCTTTGGAAATATGAAAATAG-3’ (SEQ IDΝ0:1)ο该序列的5’端进行氨基修饰。与磁珠偶联:取40 μ I羧基I μ m直径的dynal beads磁珠，Iml的0.1M MES pH4.8溶液清洗两次，定容于200 μ I的0.1M MES ρΗ4.8溶液，加入5 μ g已合成的核酸适体，和2mg的EDC室温避光反应4小时，加入2mg的BSA室温放置30分钟，用500 μ 10.02%吐温20清洗一次，定容于500 μ I的I X TE中。将Ig点心样本(康师傅蔬菜饼)加入5ml离心管，加入一定量的对应标准品菌株(ATCC35150购自ATCC)，用2mll XPBS重悬，加入100 μ I以上合成的核酸适体和磁珠，室温放置20分钟,每5分钟颠倒混匀5次。将试管在磁场中富集2分钟，小心去掉溶液，将磁珠用3mllXPBS重悬清洗两次，得到大肠杆菌0157:H7与功能磁珠的复合体。所得复合体定容于100 μ I无菌双蒸水中，对照样品为100 μ I无菌双蒸水中加入与样品中相同量的菌体，95°C加热10分钟，室温12000rpm离心5分钟，取5μ I上清用于实时定量PCR扩增检测。实施例2:大肠杆菌0157:Η7的分离富集。在实施例1合成的大肠杆菌0157:Η7核酸适体的基础上，在5’端加入8个无关碱基的连接序列，例如以下序列:5，-ttttttttTTTACTATCCCCCCATATTTCCAAATTCCCGCCCTTTGGAAATATGAAAATAG-3，(SEQ ID NO:2)。该连接序列可以有效减少磁珠的位阻效。同时，在5’端进行氨基修饰。与磁珠偶联:取40 μ I羧基I μ m直径的dynal beads磁珠，Iml的0.1M MES pH4.8溶液清洗两次，定容于200 μ I的0.1M MES ρΗ4.8溶液，加入5 μ g已合成的核酸适体，和2mg的EDC室温避光反应4小时，加入2mg的BSA室温放置30分钟，用500 μ 10.02%吐温20清洗一次，定容于500 μ I的I X TE中。将Ig点心样本(康师傅蔬菜饼)加入5ml离心管，加入一定量的对应标准品菌株(ATCC35150购自ATCC)，用2mll XPBS重悬，加入100 μ I以上合成的核酸适体和磁珠，室温放置20分钟,每5分 钟颠倒混匀5次。将试管在磁场中富集2分钟，小心去掉溶液，将磁珠用3mllXPBS重悬清洗两次，得到大肠杆菌0157:H7与功能磁珠的复合体。所得复合体定容于100 μ I无菌双蒸水中，对照样品为100 μ I无菌双蒸水中加入与样品中相同量的菌体，9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠杆菌O157:H7核酸适体，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌0157:H7核酸适体，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。2.一种大肠杆菌0157:H7检测试剂，其特征在于:所述试剂中含有如权利要求1所述的核酸适体。3.如权利要求1所述的核酸适体用于大肠杆菌0157:H7的分离富集方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将如权利要求1所述的核酸适体的5’端偶联在可分离载体上，得到分离富集载体； (2)将样本与分离富集载体充分混合，富集得到大肠杆菌0157:H7和复合载体与所述的核酸适体的复合体； (3)将复合载体上的大肠杆菌洗脱，得到从所述样品中分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴青，张艳艳，
申请(专利权)人：广州弗赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：