一种植物启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种植物启动子及其应用。本发明专利技术所提供的启动子是如下1）-3）中任一种：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。实验证明，本发明专利技术提供的启动子可以驱动目的基因在植物的根、叶及花组织中表达。本发明专利技术有助于促进人们对拟南芥发育生长的研究，且为植物特别是十字花科的蔬菜花卉的遗传改造提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明专利技术在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物启动子及其应用，特别涉及一种能驱动基因在拟南芥的根、叶及花器官表达的启动子。
技术介绍
拟南芥(Arabidopsis thaliana)属于十字花科植物,被广泛用于植物分子生物学、发育生物学、和遗传学的研究，因为其生长世代时间短、基因组小等特点使其成为了一种典型的模式植物。bHLH (basic/helix-loop-helix)蛋白是植物中的一大类转录因子,其关键结构域含有约60个较保守的氨基酸。bHLH因子可以识别基因组上的保守序列，进而在动植物及一些高等真核生物的基因转录调控中起作用。在拟南芥中至少含有130个编码bHLH蛋白的基因，这些基因在调控植物的生长发育，抗逆、响应激素等方面都起着重要的作用。启动子(Promoter)是基因组基因的一个重要组成部分，它像“开关”一样，在转录水平上基本决定其控制下的编码基因是否表达、何时表达、何处表达和表达强度。因此，对拟南芥bHLH蛋白的编码基因及其启动子的克隆将具有十分重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有启动子功能的DNA分子。本专利技术所提供的DNA分子，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)品种Columbia-O生态型,为如下I) _3)中任一种: I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。序列表中序列I由2502个核苷酸组成。含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。在本专利技术的中，所述重组载体为在pCAMBIA1391Z载体的多克隆位点插入所述DNA分子得到的重组质粒；所述多克隆位点具体为Pst I和BamH I。所述表达盒可以由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本专利技术的一个实施例中，所述目的基因具体为⑶S基因(来源于pCAMBIA1391Z载体)；所述转录终止序列具体为NOS转录终止子(来源于pCAMBIA1391Z载体)。所述DNA分子在启动目的基因在植物表达中的应用也属于本专利技术的保护范围。在本专利技术中，所述植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥(如拟南芥 Columbia-0)。在上述应用中，所述表达为在如下三个器官至少一种中的表达:根、叶和花。利用所述DNA分子培育转基因植物的方法也属于本专利技术的保护范围，该方法包括如下步骤:I)构建目的基因重组表达载体:将目的基因插入携带有所述DNA分子的所述重组载体，使所述DNA分子启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体；2)将步骤I)构建的目的基因重组表达载体导入目的植物中，得到表达所述目的基因的转基因植物。在本专利技术中，所述植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥(如拟南芥 Columbia-0)。在上述方法中，所述表达为在如下三个器官至少一种中的表达:根、叶和花。将所述目的基因重组表达载体导入所述目的植物的方法可为农杆菌介导法、Ti质粒法、Ri质粒法、植物病毒载体法、直接DNA转化法、显微注射法、电导法等，在本专利技术的实施例中具体采用的为农杆菌介导法。另外，扩增所述DNA分子全长或任一片 段的引物也属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供的启动子可以驱动目的基因在植物的根、叶及花组织中表达。本专利技术有助于促进人们对拟南芥发育生长的研究，且为植物特别是十字花科的蔬菜花卉的遗传改造提供了一条经济、快速、有效的途径。本专利技术在农业领域具有广阔的应用空间和市场前旦-5^ O附图说明图1为在重组表达载体pCAMBIA1391Z-bHLH pro-GUS中，插入bHLH启动子部分的结构示意图。图2为bHLH pro转基因拟南芥及对照野生型拟南芥的根、叶及花器官⑶S染色情况。其中，A为⑶S染色的bHLH pro转基因拟南芥根；B为⑶S染色的bHLH pro转基因拟南芥叶；C为GUS染色的bHLH pro转基因拟南芥花；D为GUS染色的野生型拟南芥根；E为GUS染色的野生型拟南芥叶；F为GUS染色的野生型拟南芥花。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。拟南芥Columbia-O 生态型:Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC),种子号:CS66730农杆菌GV3101:记载在 “The bHLH Transcription Factor MYC3Interacts withthe Jasmonate ZIM-Domain Proteins to Mediate Jasmonate Response in Arabidopsis。Cheng Zhiweij Sun Li，Qi Tiancongj Zhang Bosenj Peng Wen, Liu Yule,Xie Daoxin.Molecular Plant, 1-10.2010” 一文中，公众可以从清华大学获得。pCAMBIA1391Z 载体:此载体可从 Cambia institute 获得。http://www.cambia.0rg/daisy/cambia/2062.html branch=l&language=l,网址为 pCAMBIA1391Z 载体的图谱。实施例1、bHLH启动子序列的获得以拟南芥Columbia-O生态型的叶片为材料，提取其基因组DNA。以基因组DNA为模板，采用Forward-PstI和Reverse-BamHI组成的引物对,在高保真的PFU酶的作用下进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。Forward-Pst1:5，_aaCTGCAGcatacgatgagctttaagttttggtc_3’(大写字母部分为Pst I的识别位点，其后的序列为序列I的第1-26位)；Reverse-BamH1:5，-cgcGGATCCcaacaaaaaggaaagacttttaag-3，(大写字母部分为BamH I的识别位点，其后的序列为序列I的第2479-2502位的反向互补序列)。将PCR扩增所得产物进行测序，测序结果表明PCR产物的序列为“aaCTGCAG+序列I+GGATCCgcg^0将序列表的序列I所示的DNA命名为bHLH启动子(bHLH pro)。实施例2、转基因拟南介的犾得和鉴定一、重组表达载体 pCAMBIA1391Z-bHLH pro-GUS 的构建1、用限制性内切 酶Pst I和BamH I双酶切实施例1得到的PCR扩增产物，得到酶切产物。2、用限制性内切酶Pst I和BamH I双酶切pCAMBIA1391Z载体，回收约11.3kb的载体骨架。3、将步骤I的酶切产物本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA分子，为如下1）?3）中任一种：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.DNA分子,为如下1)-3)中任一种: 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子； 3)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为在PCAMBIA1391Z载体的多克隆位点处插入权利要求1所述DNA分子后得到的重组质粒。4.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于:所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张博森，宋素胜，齐天从，樊萌，田海霞，田翠丽，彭文，谢道昕，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：