用于治疗病毒感染的dsRNA制造技术

本发明专利技术是用于治疗病毒感染的dsRNA。涉及靶向磷脂酰肌醇4-激酶（PI4K）的基因表达的双链核糖核酸（dsRNAs），尤其涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽（PIK4CB）或人磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽（PIK4CA）的双链核糖核酸（dsRNAs），并涉及它们用于治疗由正链RNA病毒如丙型肝炎病毒（HCV）所致感染的用途。每一dsRNA包含具有这样的核苷酸序列的反义链，所述核苷酸序列长度短于30个核苷酸、通常长19-25个核苷酸，并且基本互补于PIK4CB靶mRNA或PIK4CA靶mRNA的至少一部分。许多这样的dsRNA可用于提供治疗益处。本发明专利技术也涉及包含dsRNA和可药用载体的药物组合物，并且包括递送形式如完全包封的脂质体或脂类复合体。

【技术实现步骤摘要】
用于治疗病毒感染的dsRNA本申请是中国专利申请200880023497.1的分案申请，原申请的申请日是2008年7月4日，专利技术名称是“用于治疗病毒感染的dsRNA”。专利
本专利技术涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶的双链核糖核酸(dsRNA)，尤其涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB ；ΝΜ_002651)和/或人磷脂酰肌醇4-激酶α多肽(PIK4CA ;ΝΜ_002650)的双链核糖核酸，并涉及其在治疗由正链RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)感染介导的病理过程中的用途。专利技术背景RNA依赖的RNA聚合酶正链RNA病毒形成了由许多不同亚家族组成的大的病毒超家族。这些病毒涵盖植物界和动物界两界，引起的病理学范围从轻微的表型到严重的衰弱疾病。正链RNA病毒聚合酶超群的构成如下。1.小RNA病毒组(HAV、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒)、诺达病毒(nodaviruses)、紅豆花叶病毒属(comoviruses)、线虫传多面体病毒组(nepoviruses)、马铃薯Y病毒组(potyviruses)、大麦花叶病毒组(bymoviruses)、南方菜豆花叶病毒组(sobemoviruses)和黄症病毒组(Luteoviruses)(黄化病毒、黄矮病毒和卷叶病毒)。I1.香石竹斑驳病毒组(Carmoviruses)、番爺丛矮病毒组(tombusviruses)、香石竹环斑病毒组(dianthoviruses)、痕病毒属(pestiviruses)、披膜病毒(togaviruses)、伊科病毒(echoviruses)、登革病毒、丙型肝炎病毒、黄病毒属(flaviviruses)。II1.烟草花叶病毒组(Tobamoviruses)、烟草脆裂病毒组(tobraviruses)、大麦病毒组(hordeiviruses)、tricornaviruses> 甲病毒、风疫病毒属(rubiviruses)、真菌传杆状病毒组(furoviruses)、戍型肝炎病毒、马铃薯X病毒组(potexviruses)、香石竹潜病毒组(carlaviruses)、芜菁黄花叶病毒组(tymoviruses)和苹果褪绿叶斑病毒。正链RNA病毒的基因组编码RNA依赖的RNA聚合酶，所述RNA聚合酶是唯一含有这类病毒中保守基序的病毒蛋白。由于这类病毒含有显著的系统发育变异性，所以该保守性是意义重大的，人们预计存在病毒感染细胞和维持稳定复制的多种方式。除许多不同之外，该类中的所有病毒都依赖RNA依赖的正链RNA转录这一单个基本步骤。由于该步骤对病毒生活周期是必需的，所以病毒使用许多宿主蛋白质来启动和维持RNA依赖的RNA聚合酶活性。不与宿主因子相互作用，则病毒不能存活。因此，可用于抑制病毒感染的治疗介入将是阻断病毒宿主的相互作用。如果宿主因子对病毒是必需的，但对宿主不是必需的，那么可操纵这些宿主因子，便可实现阻断病毒感染的能力。已经证实，靶向宿主蛋白质是干扰HIV、HCV、天花病毒等病毒感染和复制的有效方法。正链RNA病毒的重要性是对人类健康和生存力的影响。几种正链RNA病毒感染人类，并在许多情况下导致使人虚弱的疾病和/或病态。几种对人类健康造成特别的负担的病毒是登革病毒(出血热)、HCV (慢性肝病、肝功能衰竭、纤维样变性和癌)和HEV (暴发性肝功能衰竭)。由这 些病毒引起的肝脏和血液疾病导致全世界数以百万的死亡，并且花费医疗工业数十亿美元用于肝脏相关的疾病。找到控制病毒感染的治疗方法的意义重大，并且可改善全世界人类健康。因此，存在有效治疗由HCV和其它正链RNA病毒(以上所列)引起的感染这一未满足的需求。该说明书也涉及双链RNA分子(dsRNA)。已经表明，dsRNA以已知为RNA干扰(RNAi)的高度保守性调节机制来阻断基因的表达。W099/32619 (Fire等人)公开了至少长25个核苷酸的dsRNA在秀丽线虫(C.elegans)中抑制基因表达的用途。也已经表明，dsRNA在其它生物体包括植物(参见例如W099/53050, Waterhouse等人；和W099/61631, Heifetz等人)、果蝇(参见例如Yang, D等人，Curr.Biol.(2000) 10:1191-1200)和哺乳动物(参见W000/44895, Limmer ;和 DE10100586.5, Kreutzer 等人)中降解祀 RNA。现在，这种天然机制已经成为研发治疗由于基因异常或不想要的调节引起的病症的新型药剂的焦点。PCT 公开号 W02003016572、W02003070750 和 W02005028650 中公开了先前研发治疗由HCV感染引发的疾病的、基于核酸的RNAi药物的努力。PCT公开号W02006074346中公开了使用RNAi药物治疗RSV感染的先前的努力。尽管在RNAi领域有显著进步，并且在治疗由病毒感染介导的病理过程中有进展，但仍然需要能够抑制病毒感染进程、并且能够治疗与病毒感染相关的疾病的药剂。本专利技术公开了满足这种需要的化合物、组合物和方法，并提供了其它益处。专利技术概述本专利技术提供了用于治疗正链RNA病毒(如HCV、HPV、登革病毒和脊髓灰质炎病毒)感染的组合物和方法，所述组合物和方法通过降低细胞中(其中这类病毒可复制，如肝脏)人宿主因子磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB;NM_002651)和/或磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA;NM_002650)的活性的水平。本文公开了正链RNA病毒的增殖可通过使用双链核糖核酸(dsRNA)来抑制，从而沉默对病毒增殖必需的人宿主细胞基因PIK4CB和/或PIK4CA的表达。本专利技术提供了多种实施方案，尤其包括:用于抑制细胞中磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)水平表达或活性的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，且其中有义链包含第一序列和反义链包含第二序列，所述第二序 列包含基本互补于编码PI4K的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述互补区域长度低于30个核苷酸和其中所述dsRNA与表达所述PI4K基因的细胞接触后，抑制所述PI4K基因表达。这些dsRNA可具有化学修饰，且可与其它部分缀合。此夕卜，这些dsRNA可提供于药物组合物中。一个实施方案方法是用于抑制细胞中磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB)基因或磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA)基因的方法，所述方法包括下列步骤:(a)向细胞中引入双链核糖核酸(dsRNA),其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，且其中有义链包含第一序列和反义链包含第二序列，所述第二序列包含基本互补于编码PIK4CB或PIK4CA的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述互补区域长度低于30个核苷酸；和(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足够时间以获得PIK4CB基因(或PIK4CA，根据选择)的mRNA转录物的降解，从而抑制PIK4CB基因(或PIK4CA，根据选择)在细胞中的表达或活性。备选地，本专利技术涉及治疗由正链RNA病毒感染介导的病理学过程的方法，所述方法包括向需要此种治疗的患者施用本专利技术的dsRNA。正链RNA病毒可选自丙型肝炎病毒(HCV本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在细胞中抑制磷脂酰肌醇4?激酶表达的双链核糖核酸，所述双链核糖核酸的缩写是dsRNA，其中第一链和第二链的序列是PIK4CB1的第一链和第二链的序列，分别由SEQ?ID?NO:210和314组成，并且其中所述dsRNA与表达所述磷脂酰肌醇4?激酶基因的细胞接触后，抑制所述磷脂酰肌醇4?激酶基因的表达。

【技术特征摘要】
2007.07.05 US 60/948,100中使用的一些术语和短语的含义。如果术语在本说明书其它部分的用法与其在本部分提供的定义之间存在明显差异，那么以本部分的定义为准。[0042]“ G ”、“ C ”、“ A ”和“ U ”各自通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应当理解，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也指如下文进一步详述的经修饰的核苷酸、或者替代的置换部分。技术人员熟知，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以用其它部分进行置换而基本不会改变寡核苷酸的碱基配对特性，其中所述的寡核苷酸包含具有此种置换部分的核苷酸。例如，不作限制地，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸形成碱基对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸在本发明的核苷酸序列中可以用含有例如肌苷的核苷酸替换。包含此类置换部分的序列为本发明的实施方案。[0043]如本文所用，“靶序列”指在PIK4CB的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。[0044]如本文所用，术语“包含序列的链”指的是包含一连串核苷酸的寡核苷酸，其中所述的一连串核苷酸通过使用标准核苷酸命名法指代的序列进行描述。[0045]如本文所用，并且除非另外说明，否则术语“互补的”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时，其指的是包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或者多核苷酸杂交、并形成双链体结构的能力，这一点为技术人员所理解。此类条件可以是例如严格条件，其中所述的严格条件可以包括:400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、lmM EDTA50°C或 70°C 12-16 小时，然后洗涤。也可以应用其它条件，例如在生物体内可能遇到的生理相关条件。技术人员能够根据杂交核苷酸的最终应用来确定最适合两个序列互补性测试的条件设置。[0046]这包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在全长的第一和第二核苷酸序列上的碱基配对。在本文，此类序列可以称为彼此“完全互补的”。然而，在本文，当其中第一序列称为与第二序列“基本互补的”时，这两个序列可以完全互补，或者它们于与其最终应用最相关的条件下保留杂交能力的同时，可以在杂交后形成一个或 多个，但通常不多于4个、3个或2个错配碱基对。然而，在将两条寡核苷酸设计为在杂交后形成一个或多个单链突出时，根据互补性的测定，此类突出并不视为错配。例如，包含一条长21个核苷酸的寡核苷酸和另一长23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中较长的寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，对于本发明的目的，仍可以称为“完全互补的”。[0047]如本文所用，“互补的”序列也可包括非Watson-Crick碱基对、和/或由非天然和经修饰的核苷酸形成的碱基对，或者完全由上述碱基对形成，只要所述序列实现其对杂交能力的上述需求。[0048]在本文，术语“互补的”、“完全互补的”和“基本互补的”可以用于dsRNA有义链和反义链之间、或者dsRNA反义链和靶序列之间的碱基配对，正如其在本文的用途所理解的。[0049]如本文所用，与信使RNA (mRNA)的“至少部分基本互补”的多核苷酸指的是与目的mRNA (例如PIK4CB的mRNA或PIK4CA的mRNA)的连续部分基本互补的多核苷酸。例如，如果寡核苷酸序列与编码PIK4CB的mRNA的非间断部分基本互补，那么寡核苷酸至少与部分PIK4CB mRNA互补。同样地，如果寡核苷酸序列与编码PIK4CA的mRNA的非间断部分基本互补，那么寡核苷酸至少与部分PIK4CA mRNA互补。[0050]如本文所用，术语“双链RNA”或“dsRNA”指的是具有包含两条反向平行、并且基本互补(如上文定义)的核酸链的双链体结构的核糖核酸分子复合体。形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或者是分开的RNA分子。当为分开的RNA分子时，此类dsRNA在文献中通常称为siRNA( “短干扰RNA”)。当两条链是一个较大分子的部分、并因此通过形成双链体结构的一条链的3’末端和另一链的5’末端之间不间断的一连串核苷酸连接，连接的RNA链称为“发夹环”、“短发夹RNA”或“shRNA”。当两条链不是通过形成双链体结构的一条链的3’末端和另一链的5’末端之间不间断的一连串核苷酸而共价连接时，连接结构称为“接头”。RNA链可以具有相同或不同数...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·A·拉博，L·A·该赛，J·博劳斯基，
申请(专利权)人：诺瓦提斯公司，
类型：发明
国别省市：