大肠杆菌菌体多克隆抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌菌体多克隆抗体及其制备方法与应用。该制备方法包括以下步骤：１）分离大肠杆菌；２）将大肠杆菌置于含无菌玻璃珠和／或钢珠的生理盐水中，摇动，在８０－１２０℃下孵育１．５－３小时，离心，弃上清，用ＰＢＳ重悬后对其进行灭菌，得到大肠杆菌菌体抗原；３）将大肠杆菌菌体抗原免疫动物；４）从经免疫的动物中分离、纯化抗血清，得到大肠杆菌菌体多克隆抗体。用本发明专利技术方法制备的大肠杆菌菌体多克隆抗体具有特异性高，纯度及效价高（大于６４００），可长期保存的优点，将其用于环境及食品检测领域中大肠杆菌的免疫检测中，将具有精确性、灵敏度高和检测步骤少的优势，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗体及其制备方法与应用，特别是涉及环境检测领域中的一种大肠杆菌菌体多克隆抗体及其制备方法与其在检测大肠杆菌中的应用。
技术介绍
大肠杆菌是环境水质监测和食品安全中一种重要的指示微生物。目前，世界各国及国际组织都将大肠菌群数作为重要的环境卫生学指标，并对其在水中的浓度提出了严格的限制。世界卫生组织《饮用水水质标准》(第二版)中规定，所有饮用水中的大肠杆菌或耐热大肠菌在任意100mL水样中不得检出；现行美国饮用水水质标准国家一级饮用水标准规定总大肠杆菌(包括粪型及艾氏大肠菌)为0mg/L；中华人民共和国国家标准《生活饮用水水质卫生规范》中规定总大肠菌群及粪大肠菌群在任意100mL水样中不得检出。目前，国际上公认的大肠菌群标准检测方法以多管发酵法和滤膜法为主。我国在水和食品卫生检验标准中规定的大肠菌群数的检测方法也是多管发酵法和滤膜法。但是这两种检测方法都存在检测周期长，操作繁琐的缺点，因而难以实现对污染源的快速诊断。近年来，世界各国针对水环境和食品中大肠杆菌的快速检测进行了大量的研究工作，其中基于免疫技术原理的ELISA检测方法呈现出了良好的应用前景。免疫检测技术是利用抗原和抗体间的特异性反应，通过检测标记在反应物上的示踪物，对抗原或抗体进行定性或定量测定的快速检测技术。根据标记物质的不同，目前用于检测环境污染物的免疫检测方法主要有酶免疫分析技术、荧光免疫测定技术、化学发光免疫分析技术、免疫胶体金标记技术、免疫磁珠技术等。其中，酶免疫分析技术(Enzyme immunoassay，EIA)在环境领域中的应用较为广泛，该类技术中的酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)又是最常用的测定方法。该方法具有操作简单，特异性强，迅速灵敏的优点，在大肠杆菌的快速检测中具有优势。Vandekerchove等运用多克隆抗体ELISA方法检测了致病性大肠杆菌(EPEC)，在单个检测水平上(individual level)，该法试验得到的敏感度及特异性分别为80.0％和98.4％，而在多个检测水平上(rabbit flock level)的敏感度及特异性则降低为79.2％和85.2％(VANDEKERCHOVE DGF，KERR PG，CALLEBAUT AP，et.al.Development of a capture ELISA for the detection of antibodies toenteropathogenic Escherichia coli(EPEC)in rabbit flocks usingintimin-specific monoclonal antibodies.Veterinary Microbiology，2002.12，88(4)351-366.)。Padhye采用单克隆抗体ELISA法检测了大肠杆菌O157H7(PADHYE NV，DOYLE M P.Production and characterization of a monoclonalantibody specific for enterohemorrhagic Escherichia coli of serotypes O157H7and O2611.J Clin Microbiol，1991，2999-103)。Park等采用多克隆抗体ELISA试剂盒检测了粪便中的大肠杆菌O157，与传统的麦康凯培养基法相比，该试剂盒的灵敏度及特异性分别为91.2％和99.5％，而传统检测方法的灵敏度及特异性仅为82.4％和100％(PARK C H，VANDEL N M，HIXON D L.Rapid immunoassay fordetection of Escherichia coli O157 directly from stool specimens.J ClinMicrobiol，1996，34988-90)。Ramadan等利用ELISA检测方法在2小时内检测到了大肠杆菌O157(10-108CFU/mL)(ABUKNESHA RA，DARWISH F.Coupling of enzymaticand immunoassay steps to detect E.colia new，highly sensitive tandemtechnique for the analysis of low levels of bacteria.Talanta，2005.1，65(2)343-348)。我国姚斐等利用间接酶联免疫吸附方法检测了活的非可培养状态的大肠杆菌O157H7，最小检测浓度为105CFU/mL(YAO Fei(姚斐)，SHA Sha(沙莎)，CHEN Gang(陈刚)，et al.Indirect enzyme linked immunosorbent assay fordiagnosis of viable but nonculturable Escherichia coli O157H7.Journalof Ocean University of Qingdao(青岛海洋大学学报)，2001，31(2)211-214.)。孙克江等应用酶联免疫吸附法检测了大肠杆菌O157H7，与常规的培养等方法相比，检出率及敏感性均得到大幅提高(SUN Kejiang(孙克江)，GUO Hong(郭宏)，ZHANGDongfa(张东发)，et al.Enzyme linked immunosorbent assay for detectingO157H7.Disease Surveillance(疾病监测)，2001，16(9)353-355)。虽然ELISA检测方法操作简单，灵敏度高，但是若用该法检测所有血清型的大肠杆菌则需要广谱抗体(Broad spectrum antibody)，此外，上述试剂盒要想实现商品化仍需对其可靠性做进一步检验，而且目前检测标准尚不统一，因此，商品化受到极大限制。美国食品与药物管理局已认可使用商品化的出血性大肠肝菌O157H7的免疫检测试剂盒。我国仅中国兽药监察所分别针对大肠埃希氏菌K88、K99和987P抗原开发出了ELISA检测试剂盒，用于控制幼畜大肠杆菌病(China Institute of Veterinary DrugControl(没有具体作者).Research and application of enzyme linkedimmunosorbent assay for detecting E.coli kit.Bulletin of Agricultural Scienceand Technology(农业科技通讯)，1997，8无卷期页码)。由以上诸多文章中可见，目前国内外的研究和应用多针对致病性的大肠杆菌O157H7，还未有针对总大肠杆菌开发的ELISA检测试剂盒，而环境检测标准中所要求检测的均为总大肠杆菌。同时，各研究结果显示，针对于大肠杆菌所开发的各技术的检测限均难以满足环境检测的要求。因此，迫切需要一种环境检测领域中用于检测总大肠杆菌的ELISA试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠杆菌菌体多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：１）分离大肠杆菌，具体方法为：先将样品接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上在３６－３８℃下培养１２－３６小时，再将在牛肉膏蛋白胨固体培养基长出的菌落涂布于品红亚硫酸钠培养基上在３６－３８ ℃下培养２４－４８小时，接着挑取在品红亚硫酸钠培养基上长出的紫红色带金属光泽的单菌落，再次接种于品红亚硫酸钠培养基上在３６－３８℃下培养２４－４８小时，然后挑取紫红色带金属光泽的单菌落，接种于添加了质量百分浓度为１．４－１．８％溴甲酚紫的乳糖蛋白胨培养基中在３６－３８℃下培养１２－３６小时，待乳糖蛋白胨培养基中的紫色褪去，将菌液接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，对长出的菌落进行革兰氏染色，观察细菌形态，将鉴定为大肠杆菌的菌落再接种于伊红美蓝培养基上在３６－３８℃下培养１２－３６小时，菌落呈黑紫色的为大肠杆菌；２）将大肠杆菌培养后置于含无菌玻璃珠和／或钢珠的生理盐水中，摇动，然后在８０－１２０℃下孵育１．５－３小时，离心，弃上清，洗涤，再离心，弃上清，将菌体沉淀用ＰＢＳ重悬后对其进行灭菌，得到大肠杆菌菌体抗 原；３）将大肠杆菌菌体抗原免疫动物；４）从经免疫的动物中分离、纯化抗血清，得到大肠杆菌菌体多克隆抗体。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何苗，王娜，施汉昌，蔡强，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]