一种高脂质含量葡萄藻新品系的选育方法技术

本发明专利技术涉及葡萄藻开发利用，旨在提供一种高脂质含量葡萄藻新品系的选育方法。该方法是向葡萄藻液中加入微粒型的黄单胞多糖，置于冰水浴中用超声波将葡萄藻集落制备成单细胞；经紫外线辐射诱变及低熔点琼脂糖固定化培养后，利用尼罗红显微荧光活体筛检技术获得高含脂量的葡萄藻候选突变体；再经扩大培养和脂质含量测定选育出高脂质含量的葡萄藻新品系。本发明专利技术方法与传统选育方法相比，具有简便、高效，且可实现高通量筛检等优点，可为葡萄藻育种等提供必要的技术方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于能源微藻一葡萄藻开发利用的技术，特别涉及。
技术介绍
葡萄藻(Botryococcus)是一种世界广布的能源微藻，该藻因脂质含量通常为其细胞干重的25-35%，普遍高于小球藻等其它微藻，且脂质的组成和结构与化石原油的也最为相近，而被誉为“油藻”，以其生产航空燃油等高品质燃料一直是近年来全球生物能源领域的石开发热点之一 [Metzger & Largeau.Botryococcus brauni1: a rich source forhydrocarbons and related ether lipids.Appl Microbiol Biotechnol.2005, 66:486 - 496; Sakamoto, et al.0ptimization of light for growth, photosynthesis,and hydrocarbon production by the colonial microalga Botryococcus brauniiBOT-22.Bioresource Technology.2012, 110: 474 479.]。种子工程是农业与生物产业的基础，选育优良种质的重要性不仅在螺旋藻、小球藻等经济微藻的产业化进程中得到了充分体现，在推进水稻、小麦、玉米等农作物高产、优质、低成本生产中更是表现得淋漓尽致。值得指出的是，有关葡萄藻优良种质选育虽已受到国内外的高度重视，但在葡萄藻遗传育种研究方面迄今近乎空白，而从自然界分离藻株的适应性差、脂质产率低等问题，也正是制约着葡萄藻至今尚未能得到商业化开发应用的主要瓶颈。因此，迫切需要运用诱发突变等现代育种技术，对从自然界分离获得的葡萄藻种进行遗传改良，显著提高其对人工培养条件的适应性、生长速率及含脂量，这对实现葡萄藻的低成本工业化培殖并以之生产品质和价格等均能与化石燃油相竞争的生物燃油，推进葡萄藻制油的产业化进程，具有重要意义。目前，开展高脂质含量葡萄藻新品系选育主要面临着以下两方面的技术难题:1、葡萄藻呈由几十至几百个细胞聚集而成的集落状，其诱变频率及突变体筛选效率远低于小球藻等呈单细胞态的微藻；2、还没有建立适于筛选高脂质含量突变体的选择压力，只能先将藻液涂于平板分离培养，再将大量的克隆逐一接种到培养液扩大培养后再进行脂质测定，因而筛选的工作量大、效率低、成功率小。因此，迫切需要建立一种简便、高效、高通量的高脂质含量葡萄藻新品系的培育方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，建立。为解决技术问题，本专利技术的解决方案是:提供，该方法是:将葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，然后置于冰水浴中 ，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成单细胞；单细胞化的葡萄藻经紫外线辐射诱变及低熔点琼脂糖(lowmelting agarose)固定化培养后，利用尼罗红显微荧光活体筛检技术获得高含脂量的葡萄藻候选突变体；再经扩大培养和脂质含量测定选育出高脂质含量的葡萄藻新品系；所述的低熔点琼脂糖是指在多糖链上引入羟乙基后的琼脂糖(低熔点琼脂糖系常用的生物培养与分子操作实验素材，其熔点约为65°C，比普通琼脂糖的熔点低30°C左右)；所述的高脂质含量的葡萄藻是指脂质含量比其出发品系至少高30%的葡萄藻。本专利技术具体包括以下步骤:(I)取4 mL待测葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入微粒型黄单胞多糖，并置于冰水浴中预冷；微粒型黄单胞多糖的添加量为5粒,0.2 mg/粒,共I mg ；(2)预冷藻液经超声波处理10 s后，在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞；(3)若没有，则用每次5 s的超声波进行多次处理，直至被分散成单细胞，由此计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5Xn，单位为S，其中η为每超声处理5 s的次数；(4)用孔径为0.45 Mffl的无菌滤膜过滤藻液使藻细胞均匀平铺于滤膜上，并用紫外线进行诱变处理；(5)将滤膜上的藻细胞转移至培养液中，并使其560 nm的光密度D56tl为0.05，转Λ10 ml的PE管中，每管装4 ml，并置于37°C水浴中保温；(6)用低熔点琼脂糖固定细胞，并置于25°C光照培养箱中培养30 d ；(7)将含藻细胞的低熔点琼脂糖凝胶切成I mm厚的圆片，并置于含2%(V/V) 二甲基亚砜和I Pg/mL尼罗红的染色液中于黑暗下40°C染色10 min ；同时，按上述步骤制备对照组，其中省去步骤(4)中用紫外线诱变处理藻细胞；(8)取I片染色后的对照组藻细胞的凝胶片并展到载玻片上，置于荧光显微镜上用蓝光激发，通过调节荧光显微镜上蓝色激发光电流调控旋钮调节激发光强度直至能看到具红色荧光的葡萄藻细胞，再通过调节荧光显微镜上蓝色激发光电流调控旋钮逐渐调低激发光的强度，至显微视野中藻细胞的荧光刚好消失，记下电流表上表征此时蓝色激发光强度的电流值I，继续调节蓝色激发光电流调控旋钮使电流表的电流值降至21/3，保持此时旋钮的位置不变；(9)将经紫外线诱变的藻细胞的凝胶片用尼罗红染色后展到载玻片上，并置于荧光显微镜上用调节好光强度的蓝光激发，当观察到具红色荧光的藻细胞时，用接种针挑取相应的凝胶块，并置于含I ml培养液的2 ml PE管中，用频率为20 kHz、发射功率为100 W、以I s / I s的开/关间歇的超声波处理20 s以粉碎凝胶块，再置于25°C光照培养箱中培养30 d，即获得高脂质含量的葡萄藻新品系。本专利技术中，在步骤(2)或(3)中制备葡萄藻单细胞时，设定超声波仪的频率为20kHz，发射功率为100 W，将Φ2型变幅杆前端2 cm浸入预冷藻液，以I s / I s的/关间歇超声处理15 25 S。在本专利技术步骤(4)中，所述诱变处理是:将滤膜上的藻细胞放置于距18W紫外灯管20 cm处,用紫外线照射15 min,再避光3 h。在本专利技术步骤(6)中 ，使用与藻液等体积的浓度为2%、65°C的低熔点琼脂糖(lowmelting agarose)进行固定藻细胞。与现有技术相比，本专利技术的显著优点:本专利技术方法与传统选育方法相比，具有简便、高效，且可实现高通量筛检等优点，可为葡萄藻育种等提供必要的技术方法。具体实施例方式为提高诱变育种的诱变频率及突变体的有效筛选率，通常需将诱变材料单细胞化。本方法用适当功率超声波处理将细胞呈集落状的葡萄藻制备成单细胞。为减少超声波对藻细胞的机械损伤，本方法于超声处理前在藻液中加入少量黄单胞多糖(Xanthan gum),利用其能在藻细胞表面形成膜状物，且可使超声波能量传递变得更加平缓等特性，而达到了良好效果。紫外线是一种高效的物理诱变因子，它能使生物的遗传物质DNA发生变异。同时，尼罗红(9_ (diethylamino) benzo [a]phenoxazin_5 (5H) -one)是一类亲脂性的卩惡嗪类染料，进入藻细胞后能与胞内脂质结合并发出特异波长的荧光，且荧光强度与脂质含量呈正相关，因而可利用荧光显微镜观测藻细胞的荧光强度，筛选出脂量含量比出发品系的至少高30%的新品系。在实际筛选中，可通过调节荧光显微镜上激发光强度的电流调控旋钮使未经诱变处理的藻细胞(即出发品系)的荧光刚消失，此本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高脂质含量葡萄藻新品系的选育方法，其特征在于，该方法是：将葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成单细胞；单细胞化的葡萄藻经紫外线辐射诱变及低熔点琼脂糖固定化培养后，利用尼罗红显微荧光活体筛检技术获得高含脂量的葡萄藻候选突变体；再经扩大培养和脂质含量测定选育出高脂质含量的葡萄藻新品系；所述的低熔点琼脂糖是指在多糖链上引入羟乙基后的琼脂糖；所述的高脂质含量的葡萄藻是指脂质含量比其出发品系至少高30%的葡萄藻。

【技术特征摘要】
1.一种高脂质含量葡萄藻新品系的选育方法，其特征在于，该方法是:将葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成单细胞；单细胞化的葡萄藻经紫外线辐射诱变及低熔点琼脂糖固定化培养后，利用尼罗红显微荧光活体筛检技术获得高含脂量的葡萄藻候选突变体；再经扩大培养和脂质含量测定选育出高脂质含量的葡萄藻新品系；所述的低熔点琼脂糖是指在多糖链上引入羟乙基后的琼脂糖；所述的高脂质含量的葡萄藻是指脂质含量比其出发品系至少高30%的葡萄藻。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤: (1)取4mL待测葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入微粒型黄单胞多糖，并置于冰水浴中预冷；微粒型黄单胞多糖的添加量为5粒,0.2 mg/粒,共I mg ； (2)预冷藻液经超声波处理10s后，在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞； (3)若没有，则用每次5s的超声波进行多次处理，直至被分散成单细胞，由此计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5Xn，单位为S，其中n为每超声处理5 s的次数； (4)用孔径为0.45Mffl的无菌滤膜过滤藻液使藻细胞均匀平铺于滤膜上，并用紫外线进行诱变处理； (5)将滤膜上的藻细胞转移至培养液中，并使其560nm的光密度D56tl为0.05，转入10ml的PE管中，每管装4 ml，并置于37°C水浴中保温； (6)用低熔点琼脂糖固定细胞，并置于25°C光照培养箱中培养30d； (7)将含藻细胞的低熔点琼脂糖凝胶切成Imm厚的圆片，并置于含2%(V/V) 二甲基亚砜和I吒/mL尼罗红的染色液中于黑暗下4...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪志平，马丽芳，刘新颖，于金鑫，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：