本发明专利技术公开了一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度聚戊烯醇类脂的方法，以银杏叶、松针叶和桑叶为原料，用无水丙酮或无水C1～C3的醇为提取溶剂，在低温微波或超声波提取，制备聚戊烯醇软膏。以正己烷、乙腈和丙酮等溶剂按比例混合作为高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，上相为固定相，下相为流动相，取聚戊烯醇类脂软膏溶于下相中作为供试品，将固定相充满高速逆流色谱仪的分离柱，设定在500～1000r/min转速下，以1～5mL/min的流速注入流动相，在波长210～230nm的紫外检测器检测，离心过程先用正相离心旋转180～240min，再用反相离心旋转30～60min，待流动相开始流出色谱柱时，收集馏出液，将不同组分收集合并，经HPLC检测，制备纯度为60～90％的聚戊烯醇类脂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种应用高速逆流色谱法联用高效液相色谱从植物叶子提取分离聚戊烯醇类脂化合物的方法，属于天然药物分离和医药保健品应用领域。
技术介绍
目前国际上对于天然产物的分离技术大多采用超临界萃取技术、大孔树脂柱层析技术、分子蒸馏技术、膜分离技术等，但对于含量很低且生物活性高的天然产物，面对社会的进步和人类对高科技含量精制产品的要求，极其缺乏既能实现高纯度物质的分离纯化，又能实现相当量级制备能力的新技术。如果没有这样的新技术，就很难实现新一代产物的研发与生产，就不能实现高纯度标准物质的制备和高精度质量检定与控制方法的建立。因此，面对分离技术这一技术瓶颈，高速逆流色谱技术(HSCCC)的出现，为天然药物活性成分的分离纯化与制备带来了更优的解决方案。高速逆流色谱技术(HSCCC)，是一种以液液分配为基本原理，不采用任何固态的支撑体(如柱填料、吸附剂、亲和剂、板床、筛膜，等)，因此，对于天然产物复杂混合物中某些特定成分的高纯度单体的分离纯化与制备中有如下优势特点:1.高分离效率:分离在旋转运动中进行，两相溶剂都被剧烈振动的离心力场甩成微小的颗粒，样品各组分会在两相微粒的极大表面上分配，并能在这些颗粒振荡与对流的环境中有效地传递。实现成千上万次地、高效连续溶剂萃取过程，达到高分辨度的分离与纯化。能将样品中有效成分一步分离提纯至98%以上。2.低使用成本:分离过程不是吸附与淋洗的过程，而是对流穿透的过程，节省昂贵的填料的费用，节约溶剂的消耗；配制溶剂中大部分为水相，有机溶剂消耗少；大规模生产中可实现溶剂回收再利用。运行使用中的后续投入很低。3.易工艺放大:工艺重复性100%。从小型仪器上工艺摸索到大型仪器放大生产容易实现。4.高回收率:免除了支撑体在柱内所占空体积，无不可逆吸附、污染、变性、失活等影响，样品理论回收率100%。 5.洁净环保:整个实验生产过程封闭进行，避免溶剂挥发造成环境污染及对操作人员造成身体伤害。聚戍烯醇(polyprenols)广泛存在于绿色针叶、银杏和桑叶等植物中，是以C5异戍烯基为结构单一的类脂化合物，从结构上可分:桦木醇型《-(trans)2-(cis)n-0H、菲卡醇型《-(trans)3-(cis)n_0H和全反式爺尼醇型co -(trans)n_0H。如附图1所示。聚戊烯醇类脂对人体无毒、无致突变、无致畸和无致癌作用，具有明显的生理、药理作用。生理学研究表明，聚戊烯醇类脂对细胞膜的结构和功能具有调节作用，可改善膜的流动性、稳定性和渗透性，从而可增强膜的融合。外源性聚戊烯醇类脂在体内可代谢为多萜醇，以补充体内多萜醇的不足，对提高免疫功能、肝细胞再生、抑制癌细胞转移和辅助放、化疗等具有明显作用，也可作为癌症病人的诊断剂。拉脱维亚等国已批准用于保健食品生产和药品开发，制备了“R0PREN”系列药物。国内外对于植物聚戊烯醇的分离纯化已有文献报道，主要纯化路线是通过几次硅胶柱层析将聚戊烯醇粗提物纯度提高到90%以上。此外，还有一些其他纯化方法，如采用极性介质树脂(氧化铝或聚酰胺等)吸附，溶剂萃取和结晶，得到纯度为70% 75%的聚戊烯醇产品，得率1.0%左右。采用石油醚-乙酸乙酯冷冻脱杂后再进行硅胶柱层析纯化，制备纯度92.7%聚戊烯醇。但产品中仍含有大量的类胡萝卜素等黄色素，Tetsuo Takigawa等曾采用活性炭一种脱色剂对聚戊烯醇粗提物脱色，但活性炭用量大，脱色效果差，聚戊烯醇损失大HSCCC分离效率高、操作简单，样品不需要严格的预处理；可从极复杂的粗制样品中一步分离得到高纯度的组分，可以分离黄酮、生物碱、醌类、类脂等小分子化合物，也可以分离多肽、多糖、蛋白质等高分子化合物，重现性良好。目前还没有文章和专利报道采用高速逆流色谱法分离聚戊烯醇。 本专利技术将富含聚戊烯醇类脂的新鲜植物叶子，通过室温浸泡，或经微波提取或超声波提取，制备含量5 20%聚戊烯醇类脂软膏，再采用高速逆流色谱技术，制备60% 90%聚戊烯醇类脂，为高纯度聚戊烯醇批量制备和医药品的开发提供技术。
技术实现思路
为实现上述目的，专利技术了，由以下步骤组成:第一步，聚戊烯醇类脂提取将富含聚戊烯醇类脂的新鲜植物叶子，室温阴干，破碎至100目以下粉末，加入无水丙酮或Cl C3醇中任一种溶剂，叶子与溶剂按质量比为1: 8 30，优选1: 8 15，在室温 80°C浸泡10 72小时，如25 50°C，静泡30 50小时；或经微波提取或超声波提取10 60分钟，提取功率100W 1000W，两次，合并提取液，真空回收有机溶剂，浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏，软膏相对于植物叶子粉末收率4 10%，聚戊烯醇类脂含量5 20% ；第二步，高速逆流色谱分离I)按体积比选择正己烷:乙腈:丙酮=3 4: 0.5 1: 0.8 1.5溶液作为高速逆流萃取溶剂体系，三种溶剂混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气；2)取聚戊烯醇类脂软膏溶于下相中作为供试样品，所述聚戊烯醇的软膏与下相的质量体积比(g/mL)为1: 20 80 ;3)将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，高速逆流色谱仪分离条件在500 1000r/min转速下，以I 5mL/min的流速注入流动相,在波长210 230nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始供试样品溶液进样，整个离心过程先采用正相离心旋转，时间为180 240min，再采用反相离心旋转，时间为30 60min，用自动馏分收集器收集馏出液；第三步，高效液相色谱检测将第二步自动馏分收集器收集馏出液，用高效液相色谱进行检测聚戊烯醇类脂部位集分，合并聚戊烯醇类脂集分，回收有机溶剂，浓缩物为黄色聚戊烯醇类脂油状物，聚戊烯醇类脂含量60 % 90 %。本专利采集的新鲜叶子为银杏叶、针叶和桑叶中任一种，银杏叶为8月至12月期间采集的新鲜叶子，3 10年树龄的银杏叶于8 10月采集，10年以上树龄银杏叶在10 12月采集，含有异戊烯基单元数为15 23聚戊烯醇类脂。松针为2月 8月期间从马尾松、湿地松、黑松、雪松、海岸辐射松和油松中任一种采集的新鲜叶子，富有异戊烯基单元数为13 19聚戊烯醇类脂。桑叶为8月10月期间采集的新鲜叶子，含有异戊烯基单元数为10 12聚戊烯醇类脂。传统提取方法采用石油醚、正己烷、氯烷、乙酸乙酯、丙酮等作为非极性或弱小极性的提取剂提取植物聚戊烯醇类脂化合物，提取率一般3 6%，本公利首次采用极性较大的无水醇溶剂作为提取剂，如公开的Cl C3醇提取剂为甲醇、乙醇、正丙醇中任一种，同时采用无水丙酮作为提取剂，扩大了聚戊烯醇提取极性，也明显提高了聚戊烯醇提取率和收率。本专利公开在室温 80°C浸泡10 72小时，如25 50°C，静泡30 50小时；或经微波提取或超声波提取10 60分钟，提取功率100W 1000W，两次，合并提取液，真空回收有机溶剂，浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏，软膏相对于植物叶子粉末收率4 10%，聚戊烯醇类脂含量5 20 %，与传统方法相对，提取效果明显提高。传统分离方法通过多次硅胶柱层析将聚戊烯醇粗提物纯度提高到90%以上，不但时间长，而且溶剂和硅胶多，尤其硅胶不能再生利用，成本高；采用极性介质树脂(氧化铝或聚酰胺等)吸附，溶剂萃取和结晶，只本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度聚戊烯醇类脂的方法，其特征在于由以下步骤组成：第一步，聚戊烯醇类脂提取将富含聚戊烯醇类脂的新鲜植物叶子，室温阴干，破碎至100目以下粉末，加入无水丙酮或C1～C3醇中任一种溶剂，叶子与溶剂按质量比为1∶8～30，在室温～80℃浸泡10～72小时，或经微波提取或超声波提取10～60分钟，提取两次，合并提取液，真空回收有机溶剂，浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏，聚戊烯醇类脂含量5～20％；第二步，高速逆流色谱分离1)按体积比选择正己烷∶乙腈∶丙酮＝3～4∶0.5～1∶0.8～1.5溶液作为高速逆流萃取溶剂体系，三种溶剂混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气；2)取聚戊烯醇类脂软膏溶于下相中作为供试样品，所述聚戊烯醇的软膏与下相的质量体积比(g/mL)为1∶20～80；3)将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，高速逆流色谱仪分离条件在500～1000r/min转速下，以1～5mL/min的流速注入流动相，在波长210～230nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始供试样品溶液进样，整个离心过程先采用正相离心旋转，时间为180～240min，再采用反相离心旋转，时间为30～60min，用自动馏分收集器收集馏出液；第三步，高效液相色谱检测将第二步自动馏分收集器收集馏出液，用高效液相色谱进行检测聚戊烯醇类脂部位集分，合并聚戊烯醇类脂集分，回收有机溶剂，浓缩物为黄色聚戊烯醇类脂油状物，聚戊烯醇类脂含量60％～90％。...
【技术特征摘要】
1.一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度聚戊烯醇类脂的方法，其特征在于由以下步骤组成: 第一步，聚戊烯醇类脂提取 将富含聚戊烯醇类脂的新鲜植物叶子，室温阴干，破碎至100目以下粉末，加入无水丙酮或Cl C3醇中任一种溶剂，叶子与溶剂按质量比为1: 8 30，在室温 80°C浸泡10 72小时，或经微波提取或超声波提取10 60分钟，提取两次，合并提取液，真空回收有机溶齐U，浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏，聚戊烯醇类脂含量5 20% ; 第二步，高速逆流色谱分离 1)按体积比选择正己烷:乙腈:丙酮=3 4: 0.5 1: 0.8 1.5溶液作为高速逆流萃取溶剂体系，三种溶剂混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气； 2)取聚戊烯醇类脂软膏溶于下相中作为供试样品，所述聚戊烯醇的软膏与下相的质量体积比(g/mL)为1: 20 80 ; 3)将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，高速逆流色谱仪分离条件在500 1000r/min转速下，以I 5mL/min的流速注入流动相,在波长210 230nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始供试样品溶液进样，整个离心过程先采用正相离心旋转，时间为180 240min，再采用反相离心旋转，时间为30 60min，用自动馏分收集器收集馏出液；第三步，高效液相色谱检测 将第二步自动馏分收集器收集馏出液，用高效液相色谱进行检测聚戊烯醇类脂部位集分，合并聚戊烯醇类脂集分，回收有机溶剂，浓缩物为黄色聚戊烯醇类脂油状物，聚戊烯醇类脂含量60% 90%。2.根据权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：王成章，闵凡芹，何源峰，原姣姣，陈虹霞，叶建中，周昊，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林产化学工业研究所，
类型：发明
国别省市：
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